干细胞因子纯化原理

动物细胞储存的方法 2023年07月22日 15:30 83 im

　　干细胞因子是一类具有调节干细胞增殖和分化能力的生物大分子，对人类健康和疾病治疗有着重要的作用。干细胞因子的分离和纯化是干细胞研究领域中的关键问题之一。本文将介绍干细胞因子纯化的原理与方法。

　　干细胞因子的纯化需要先获得高效的表达和产生。常用的表达系统包括细胞培养、小鼠肿瘤细胞、昆虫细胞等。在表达系统的选择时需要考虑到表达量、表达成本和纯度等多个因素。

　　分离和纯化干细胞因子的方法较为复杂，需要遵循分步骤的原则。以下是通常采用的纯化方法：

　　超滤和透析是干细胞因子最初的分离和纯化方法。这种方法需将蛋白溶液通过超滤膜，或将其放入透析袋内，用生理盐水或缓冲液进行洗涤，使分子量较小的物质得以经由膜而出，物质溶液中富集了目标蛋白，进一步充分加浓梯度整合目标蛋白。

　　电泳分离是通过电场区分蛋白质的分子量，从而达到蛋白的纯化目的。在 SDS-PAGE中，由于所有蛋白质均被同样的负电荷所包围，因此电泳分离过程中，蛋白质的迁移速率与其分子量成反比例关系。然后在凝胶中切出目标区块，在可溶性缓冲中洗去SDS，可用于下一步纯化。

　　亲和层析法是基于目标蛋白与某些具有特异性的配体之间的结合力而发展起来的。如Ni-NTA层析柱。在此方法中，使用配体(Ni2+络合的树脂)与蛋白质表面上的暴露的亲和区域相结合，以便通过树脂的再循环和洗涤来从复杂的混合物中分离目标蛋白。

　　葡聚糖的化学结构与干细胞因子的结构有微小倾向的吻合，因此可以确保在列技术中被捕获和纯化的干细胞因子纯度不同于任何其他蛋白质插入此树脂。通过在某些pH值和离子浓度下选择性结合蛋白质，使得蛋白质从复杂的混合物中被提取出来。

　　干细胞因子的纯化过程中常见的问题包括：

非特异性结合：非特异性结合是通过其它非目标性蛋白质而导致的，可用降低非特异性结合条件、添加蛋白酶抑制剂、电泳、SDS-PAGE等方法解决
亲和柱的选择：对于相同的葡聚糖或其他化合物做不同的处理(如硫酸化程度)，可以得到不同的生物学性质或亲和性，构建同一层留树脂的多柱基底可以配备稳定，重现性高的产品。
产率低：通常缺乏特异性和优秀的分离手段是导致产率低的原因，通过前期实验调整条件与方法后，可大大降低产率低的问题，如：运行参数，样品预处理，特定细胞系培养工艺等, 可以提高产量出品质量。
多肽交叉污染：在成功完成舒尔特曼信号串联反应后，需要装填抗体并通过western blot验证多肽是否唯一。注意抗体对结构和肽链取向的要求，以消除多肽的结构或交叉污染。
残留污染物：根据不同的纯化步骤，在执行下一步之前为每一步进行彻底的污染物清洗，半洗涤缓冲液可以用于中间洗涤步骤。