外泌体生信分析（外泌体研究套路）

本文目录一览：

• 1、求教有了解思路迪诊断外泌体蛋白辅助诊断早期卵巢癌项目的吗？简单介绍下
• 2、外泌体多组学02-体液来源外泌体的组织和细胞类型溯源
• 3、脑脊液 | 生物标志物分类
• 4、冰晶蓝外泌体是真的吗
• 5、重磅！非因指南性综述引领液体活检蛋白组技术新风尚!
• 6、细胞外泌体是什么？

求教有了解思路迪诊断外泌体蛋白辅助诊断早期卵巢癌项目的吗？简单介绍下

这个项目是由思路迪诊断开发团队历经多年研究出来的成果，将高效的外泌体提取方法与高敏的化学发光免疫分析法相结合，开创性地开发出了外泌体卵巢癌辅助诊断试剂盒，并且在全自动化学发光平台上建立起了一个基于三指标检测结果的自动分析模型OCS，可直接对检测结果进行分析，进而提示受试者卵巢附件包块的恶性风险。

并且，作为优秀的高新企业代表，上海思路迪生物医学科技有限公司不负众望，“外泌体蛋白辅助诊断早期卵巢癌”项目成功入围全国颠覆性技术创新大赛领域赛，这个项目不仅再度彰显了思路迪诊断技术上的雄厚实力，也为临床医生在发现、诊断卵巢癌时，提供了更精准、更便捷的应用辅助。

外泌体多组学02-体液来源外泌体的组织和细胞类型溯源

外泌体(30~150nm大小)是活细胞分泌的最小类型的细胞外囊泡(为30~1000nm)，通过所有体液的循环系统，如血液、尿液和眼泪，作为细胞间的信使。体液外泌体的来源混杂，可以是任何组织和细胞分泌的外泌体然后经体液循环进入。

其中，尿外泌体可以反映病理生理学，并为肾相关功能障碍提供生物学理解，是泌尿系统癌症很有前途的生物标志物来源。

尿外泌体和泌尿/非泌尿器官或细胞之间的遗传网络仍不清楚，本文旨在对尿外泌体bulk RNA-Seq数据进行组织和细胞类型溯源，为外泌体应用于疾病诊断和治疗提供重要理论依据。

本次介绍的文献信息如下：

在我们的体液中，纳米级细胞外囊泡的遗传起源尚不清楚。在这里，我们通过RNA测序对尿外泌体进行了跟踪分析，发现尿外泌体主要表达膀胱的组织特异性基因，并与内皮细胞、基底细胞、单核细胞和树突状细胞有密切的细胞遗传关系。对癌症的差异表达基因进行追踪和相应的富集分析显示，尿外泌体密切参与免疫活动，这表明它们可以作为癌症基因组诊断和精确医学中非侵入性液体活检的可靠生物标志物。

数据情况：

ssGSEA：观察到肾和胃的TSG在膀胱癌和对照样本中有差异表达(图1B)；相比之下，膀胱、肺、脑和肝脏的TSG在肾癌样本及其对照组中存在差异表达Fig. 1C。

细胞类型signature matrix：

来自于 HCL，human cell landscape (HCL, )的单细胞数据和markers，主要包括肾脏的16种细胞类型与膀胱的16种细胞类型

CIBERSORT：构建了一个细胞类型矩阵，并研究了外泌体的细胞水平来源(Fig. 1D)：

bulk RNA-seq分析通常通过识别DEGs来比较不同条件下的转录本丰度。当整个组织的RNA-seq(bulk RNA-seq)完成时，确定基因表达的变化 在多大程度上是由于细胞类型比例的变化 通常是一个挑战。而这一挑战可以通过单细胞RNA-seq(scRNA-seq)方法来解决。bulk RNA-seq通过去卷积分析，可以估计细胞类型比例的变化。

下面这张图展示了 细胞类型的特异性和细胞类型的比例如何导致基因差异表达(DEG) ：

在上图中，形状表示细胞类型，每个形状的数量表示相对的细胞类型比例。颜色代差异分组。点代表每个细胞内基因表达水平。

使用了一个工具scMappR：分配贡献DEG的细胞类型，并确定了cwFoldChange最高的细胞类型

肾癌标志物中的S100A10和CCAR1，膀胱癌标志物中的CD248和MT-ATP已被证明在尿癌中具有促进肿瘤的功能

意外发现：DDX17的表达水平呈明显的变化趋势：肌肉浸润性膀胱癌 非肌肉浸润性膀胱癌 DDX17表达，这可能是由于人类RNA解旋酶DDX17通过调节几种DNA和染色质结合因子的选择性剪接来促进肿瘤细胞的侵袭性

各组的基因组合可以提高肿瘤样本与相关良性疾病样本的准确性，对这两种尿路癌的早期诊断具有指导意义

主要结果：

研究意义：

文献中使用的软件 scMappR 利用单细胞数据构建signature matrix来对bulk RNA-Seq进行去卷积分析，我们下期介绍~~~

脑脊液 | 生物标志物分类

参考资料：2018 Handbook of Clinical Neurology. The use of cerebrospinal fluid in biomarker studies.

脑脊液(CSF)中的多种成分，可用于多种目的的生物标志物研究，用于神经系统疾病通路中重要导联的诊断、预后、监测和识别。目前已广泛用于multiple sclerosis diagnosis和AD (tau蛋白的表达水平和磷酸化水平)的诊断。

由于需要通过腰椎穿刺获取脑脊液，属于侵入性取样，因此与其他样本（如血液）相比，脑脊液样本显得格外珍贵。

蛋白标志物主要有以下3种。

蛋白标志物的常用分析方法： ELISA（针对特定已知蛋白）和蛋白组学（蛋白质谱技术） 。CSF中的蛋白浓度比血浆中低大概200倍，因此需要高敏感度的方法来检测。

代谢物是细胞代谢的终产物或中间产物，参与能量转换、信号传导、表观修饰等过程。 CSF中最常用的代谢标志物是葡萄糖含量，其可作为感染、炎症、恶化等过程的标志物。

代谢组学方法：质谱分析法可分析了许多生物样品中不同的代谢物；核磁共振波谱法。

正常细胞在凋亡后会释放cfDNA,外周血中的cfDNA一般在150-200bp。CSF中的cfDNA主要用于 检测恶性肿瘤的体细胞突变或病原体感染 。肿瘤细胞释放的cfDNA的长度变化范围更广、可直接用于检测体细胞突变；CNS感染病原体后，来源于病原体的cfDNA可用于鉴定病原体。

检测方法：PCR（针对点突变）或全基因组测序

miRNA更加稳定，是内源性的非编码RNA，参与mRNA调控并介导多种细胞过程，通常长22-24核酸，并有发卡结构。

miRNA的异常表达模式已在多种神经退行性疾病中被报道 ，如multiple sclerosis, AD, trauma, CNS tumors.

检测方法：RT-PCR / qRT-PCR (针对特定miRNA); 二代测序（针对新的miRNA）

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在30–100 nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。

多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。其中 包含DNA、多种类型的RNA、脂质、蛋白和代谢分子等。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

胞外囊泡（1-2um)和外泌体(30-100nm)已被视为神经退行性疾病和恶性肿瘤生物标志物研究的热点。

方法：超速离心获取外泌体，，然后提取其中的mRNA或DNA。

作者大篇幅介绍了CSF成分的不稳定性，指出有多种因素会影响到分析结果。将其分为两类：患者相关的因素和环境（实验处理）因素。

不同对照组的纳入标准不同，由临床标准和实验室标准组成 （Table 1.4)。

QAlb：血浆和脑脊液之间的蛋白浓度梯度是由血-脑脊液屏障功能引起的，脑脊液球蛋白和与白蛋白的比例变化称作蛋白商。

现在常通过组学（蛋白组学等）方法比较疾病早期的CSF和晚期的组织，来鉴定新的标志物。如常用的蛋白质谱法，但是目前能用于临床的标志物仍然很少，这主要归因于两点：一是目前的蛋白质谱的敏感度有限；二是CSF中蛋白含量很低。

另一个方法是利用多重抗体或aptamer-based芯片来提高抗体敏感性。这种芯片可以检测超过1000种蛋白。或者针对组织进行组学测定，找到差异表达蛋白，然后在CSF中检测这些蛋白；或根据溶解度和分泌亚型对CSF是否存在某些蛋白先进行预判。

冰晶蓝外泌体是真的吗

说起冻龄美女你的脑海中第一个会想到谁？是青春可爱并且从小美到大的韩国演员宋慧乔，还是颜值和身材并存的杨幂？或者你还会想到哪一位与奶奶同辈但却可以一直保持20年前颜值高峰的“白素贞”赵雅芝？当然你可能还会想到哪位万千宅男的梦中情人“奶茶妹妹”章泽天。不过在这里值得说一句的是：现在20多岁的小姑娘皮肤好并不是她们多会保养，而是在年龄上占了非常大的优势，如果你到了40岁皮肤依旧可以像20多岁那样的话，那么才算得上真正的本事。现代很多女生都十分向往买一些昂贵的奢饰品，如包包、衣服，鞋子等等总觉得这些昂贵的奢饰品才能彰显自己高品质生活，但实际上我们的皮肤才是那个最容易出卖生活品质的罪魁祸首。

现在很多人自拍只要把美颜一开就会个个都宛如20岁，但是把美颜关了之后很多“东西”就会暴露出来，如鱼尾纹、抬头纹、法令纹等分分钟把你从梦幻世界拉回现实世界。其实从人的皮肤原理来分析：女性到了25岁之后，皮肤就会开始慢慢的走下坡路，如有骨骼支撑的皮肤会以每年0.02公分下垂，而没有骨骼支撑的皮肤每年会以0.06公分下垂，所以这也是为什么很多女性在25岁之后就会发现脸虽然还是自己的脸，但总会觉得没有以前那么精致了的原因。而为什么打开相机美颜功能40岁阿姨可以秒变20多小姐姐，其实很大的原因就是脸上皱纹没有了，然后皮肤也变得光滑、立体并且紧致了。

其实脸上的皱纹是最容易暴露女性的年龄的，皱纹和毛孔粗大、青春痘、粗糙等皮肤问题是有本质上的不同，女性的面部一旦出现有皱纹就意味着面部胶原蛋白不充足了，因为胶原蛋白的缺失使得无法去支撑皮肤，最后导致皮肤开始慢慢下垂，然后出现鱼尾纹、法令纹、木偶纹等，还有并伴随着胶原蛋白的流失一些皮肤问题也会随之而来，如常见的黑头、毛孔粗大和色斑等。肌肤的老化其实是一个群体的反应，通常都是有一个去引发多个，最后一点点把你推向“黄脸婆”的行列里面去。但如果你能让肌肤变得紧致起来、提升脸部轮廓、补充到足够的胶原蛋白，那么让你重回20岁的颜值巅峰也不是不可能的。今天我们就聊一聊今年在抗衰届很火的一个抗衰项目：外泌体。

首先外泌体是什么？

外泌体无疑是眼下生物科学领域最炙手可热的研究对象，它仅仅在几十年时间里就就在“囊泡运输”研究领域拿下了4次的诺贝尔生理学或医学奖，可以说得上是名副其实的“诺奖实力派”，在2013年的时候诺贝尔就授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼和德国科学家托马斯·祖德霍夫生理医学奖，以此来表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制。

其实外泌体就好像是一位快递员，它主要是负责细胞之间的物质运输和信息传递，它从细胞阶段抗衰，传递运输营养或某种活性物质，发送抑制信号让炎症因子“闭麦”；其中发送促进信号可以加快细胞再生和胶原合成等让皮肤健康焕新。严格意义上来讲外秘体就是细胞的囊泡，它可以分泌出很多种细胞因子和大量的胶原因子，通常它的直径会在30-100纳米，简单来讲就是头发的千分之一，它可以自由的进入细胞的间隙（从表皮到真皮），外泌体作为细胞美容的升级版，它不仅克服了细胞的局限性，而且又可以设定明显的靶向性，为皮肤组织修复与改善开辟了新角度。

为什么抗衰需要外泌体？

衰老不是一天形成的。世界卫生组织说：“皮肤衰老的本质是细胞的衰老”。也就说所有的皮肤问题最终都会归结到细胞上，就拿皮肤的细胞来说：要是一个人的皮肤细胞出现了问题，那么会很容易出现以下这几种情况，一是炎症问题会造成细胞间的通讯中断，然后使得皮肤的自我调节功能无法正常工作。第二细胞一旦受损就很容易使得细胞的新陈代谢出现问题，如果细胞的生命周期变短后细胞分裂更新速度变得非常缓慢，这样一来就会随着人的年龄增长胞也会慢慢的“集体衰老”，而一旦衰老细胞会长时间累积起来后就会出现肌肤暗黄干燥、长皱纹等问题。

而能够直接调控细胞的外泌体就无疑是像拿到了影响细胞的关键钥匙，它会像一个小精灵一样利用细胞记忆去智能调控肌肤修复方向，并且激活自体细胞再生力和加强新陈代谢能力。而且外泌体作为细胞护肤的主要成分对多种细胞生理功能和代谢功能都能发挥生物调节作用，接着直接或间的去影响多种类型的细胞的生长、分裂、分化、扩增以及迁移。对那些受损细胞或失活细胞都进行一一的修复和唤醒工作，并且重建细胞屏障、激活皮肤细胞分化以及促进再生从源头上实现抗衰。此外还有研究表明：通过对细胞的整体应用可以在一定程度上恢复正常分泌的协调性，细胞的整体应用起到不单单是修复肌肤的作用，还能使得原有的肌肤和身体内环境变得年轻起到一个逆龄的效果，而这也是外泌体在美容领域备受很多明星青睐的原因。

重磅！非因指南性综述引领液体活检蛋白组技术新风尚!

2022年2月15日，非因生物以第一作者和通讯单位、联合美国纽约圣约翰大学陈哲生教授等在《Molecular Cancer》杂志上（ IF：27.401 ）发表了题为“Proteomics technologies for cancer liquid biopsies”的综述性文章，回顾了包括RPPA在内的多种高通量蛋白质组学技术在肿瘤液体活检中的研究进展及临床转化应用策略。

本文简要介绍了能够从液体活检样本中同时检测至少数百种蛋白质的高内涵蛋白质组学技术原理（图1），包括：RPPA反相蛋白微阵列技术（非因生物提供）、质谱技术、抗原/抗体阵列技术、基于核酸适配体（Aptamer）的检测技术和邻位延伸技术（PEA），并比较了上述各技术的优劣势（表1，嫌长不看也要看的表），同时介绍了各技术在癌症液体活检研究领域和临床转化方向的应用进展。（ 原文链接： ）

蛋白组学液态活检生物标志物研究背景

与肿瘤诊断的“金标准”组织活检相比，液体活检可通过最小入侵方式获得检测样本，同时克服异质性，实现动态监测。目前用于液体活检的体液主要为血液和尿液，但理论上，液体活检适用于任何人体内循环或其他人体相关的液体（图2）。作为大多数细胞功能的直接执行者和当前大多数癌症治疗中的直接药物靶标，多重蛋白质组学数据的分析，可能会在癌症进展的所有阶段实时提供更加宝贵的临床相关信息。液体活检样本中的蛋白质组具有巨大复杂性，如蛋白质丰度和翻译后修饰持续且快速的变化，同时蛋白质组技术与高度复杂的测序技术相比仍存在一定局限性，导致蛋白质组学的探究仍然落后于基因组技术，且目前临床转化效率极低，仅通过40多个基于液体活检的蛋白组生物标志物。因此，迫切需要新的蛋白质技术来实现在癌症液体活检中发现生物标志物的目标。

各技术比对

一、 质谱技术（MS）

由于体液样本中蛋白的复杂性，现代质谱技术通过不断优化样本制备方法、开发蛋白定量技术以及改变质谱扫描模式来提高检测精度。质谱法无需假设驱动，可以无偏倚地对样本中的蛋白进行扫描，因此可作为癌症体液样本早期生物标志物发掘的首选方法。目前基于质谱的生物标志物策略主要有：（1）在发现、核实、验证三个阶段，样本数量递增，而检测蛋白范围逐渐缩小的 “三角策略” ；（2）在发现和验证阶段均用“鸟枪法”在大样本队列检测尽可能多的蛋白，平行分析显示共同显著差异的蛋白可作为准生物标志物的 “矩形策略” 。目前基于质谱的液体活检已应用于卵巢癌、泌尿系统癌症、结直肠癌等多种癌症。但如想将质谱应用于广泛的临床试验，还需简化和标准化检测流程、提高检测的通量、精度和鲁棒性，并突破对翻译后修饰蛋白的检测局限性。

二、抗原/抗体阵列技术

抗体阵列 是将特异性抗体固定到带有修饰的平面基质上，通过荧光、化学发光或寡核苷酸标记的方式对样本进行多重靶标（通常为几百种）检测的方式。适用于血清学分析，如肿瘤相关的低丰度分泌蛋白的检测。但受到检测通量、检测动态范围、以及批次效应和信号饱和度、定量精确度的限制，抗体阵列仅可作为基于体液的蛋白组学分析的方法学之一。 抗原阵列 又称功能蛋白阵列，可作为抗原检测平台来检测抗体组成的细微变化，其早期热点应用是通过血清自身抗体（AAB）来进行生物标志物的研究。最全面的人类抗原阵列覆盖超过81%的蛋白，是血液蛋白全景分析的强有力的工具。但抗原阵列的靶点扩展、可重复性、批次效应和高昂的成本，仍使抗原阵列的应用有所局限。

三、 基于适体的检测

SOMAscan是目前高通量蛋白组检测的“新贵”工具，基于能够与不同蛋白质进行紧密结合的慢速率修饰的蛋白质适体（SOMAmer）进行检测。SOMAmer是寡核苷酸配体，结合上可光解的接头或荧光标签，通过构象识别与待测靶标结合，经生物素介导的纯化后，紫外光照射洗脱SOMAmers，并对其进行表征和定量已反应待测样本内的蛋白丰度。该方法具有超高特异性和亲和力，以及较低的批次间差异，目前可平行分析7000+种蛋白质，在结直肠癌和非小细胞肺癌的临床相关的生物标志物筛选中起到关键作用。但与抗体检测相比，现阶段可供研究使用的适体种类有限，尤其是翻译后修饰蛋白为导向的适体开发仍处于初期阶段。同时由于适配体对抗原决定簇的超高亲和力，在蛋白标志物研究的进程中会受到大量信号干扰，影响检测准确度。

四、邻位延伸技术（PEA）

PEA结合了基于抗体的免疫分析（ELISA）和PCR或二代测序（NGS）技术，与质谱检测相比，实现了用更低的样本量检测更广泛的动态范围，高灵敏、高准确、可重复且高保真识别。最先进的PEA检测目前由Olink商业化，可对3072个靶标进行标准测量。PEA首次应用于结直肠癌血液预后标志物的鉴定，后续应用于卵巢癌、前列腺癌等癌种的早期检测、伴随诊断和疾病监测。PEA检测与读取方式（qPCR、NGS）相关，当进行大队列样本分析时，仍需考虑实验误差和批次效应，其次翻译后修饰蛋白的研究对于抗体对开发具有很大瓶颈，对其捕获受到一定限制。

五、反相蛋白微阵列技术（RPPA）

RPPA起源于20年前，是将完全变性的蛋白裂解液固定在特殊载玻片上，通常每种裂解液会进行浓度梯度稀释，接下来用验证好的高度特异性的抗体孵育点样后的载玻片，通过信号放大化学显色或荧光检测捕获定量信息（图3）。RPPA可广泛应用于几百到超过一千个大样本的超稳健平行分析，定量精准，可对500+种细胞表面受体蛋白、细胞信号关键蛋白及蛋白修饰（磷酸化、乙酰化、甲基化等）、蛋白酶类、转录因子等各类代表性靶标进行分门别类的系统深度检测，包括直接和间接的上下游蛋白网络分析。基于以上特征，RPPA广泛应用于癌症基因组图谱项目（TCGA），其公共数据集可在线获取（TCPA，）。RPPA由于其最小的批次差异，可以作为蛋白质生物标志物验证的强大工具，并已成功应用于肺癌的新型生物标志物验证。另外，对外泌体蛋白的检测也成为RPPA在癌症液体活检中的另一项热点应用。 非因生物在国内搭建了基于MD安德森金标准的RPPA分析技术平台，先期完成了一系列工作流程的开发、验证及优化，不断扩展抗体库，并且建立了完备的生信分析体系。帮助国内科研，临床及工作者及广大药物研发相关用户快速高效开展疾病，尤其是肿瘤相关信号通路全景分析、分子机理挖掘、肿瘤相关药理学研究及靶向药物开发。RPPA复杂的技术流程和严格的抗体筛选过程将不再成为国内科研工作者的开展基础和转化医学研究的绊脚石。（点击下方“ 阅读原文 ”，了解详情）

展望

未来，在蛋白质组学技术不断发展的前提下，各技术之间的联合互补应用可以作为可行的、基于肿瘤体液活检的生物标志物正交验证策略(如图4所示)。非因生物依托RPPA技术等各项新型组学技术，将肿瘤精准治疗研究和转化作为核心使命，我们期待着一个更加精简但连贯且标准的蛋白类生物标志物开发流程的出现，并最终应用于癌症转化医学研究。

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。