外泌体nta结果怎么看（外泌体nta检测）

2022-12-20 12:30:09 作者：max

本文目录一览：

1、细胞外泌体是什么？
2、P12-组织EVs蛋白组与scRNA-seq联合揭示EVs在炎症中驱动骨髓中性粒细胞募集
3、外泌体提取策略
4、手机上怎么查看核酸检测结果手机上核酸检测结果怎么查
5、验孕棒怎么看结果图片，验孕棒怎样看结果？怎么识别有没有怀孕？

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

外泌体nta结果怎么看（外泌体nta检测）

P12-组织EVs蛋白组与scRNA-seq联合揭示EVs在炎症中驱动骨髓中性粒细胞募集

细胞外囊泡(EVs)是一种单膜囊泡，在远距离的细胞间通信中发挥重要作用。EVs的研究主要通过细胞培养系统进行了探索，但目前尚不清楚生理EV如何在体内发挥稳态或病理功能。在这里，我们报道了肺EVs通过传递双链DNA(dsDNA)促进骨髓中中性粒细胞的趋化。

标题： Extracellular vesicles from lung tissue drive bone marrow neutrophil recruitment in inflammation

DOI(url): 10.1002/jev2.12223

日期及杂志： J Extracell Vesicles. 2022

作者及单位： Yuxin Yin，北京大学健康科学中心基础医学科学学院系统生物医学研究所

数据主要分为免疫细胞与非免疫细胞两大群：

肺组织EVs蛋白与单细胞Cluster交集情况：identified as “Cluster Markers”, “Non-Cluster Markers” or “Not detected” (Supplementary Tables 1 and 2).

使用透射电镜(TEM)观察到了正常肺组织中存在的各种EVs和MVEs

为了从正常肺组织中收集高质量的 EVs，我们开发并优化了一种基于差异离心的方案，如图所示：

在小鼠样本中，EVs相关蛋白(ALIX、TSG101、CD9、CD81)在110,000×g颗粒(P110kg)中高度富集，而高尔基体(GM130)、内质网(Calnexin)和线粒体蛋白(TOM20、VDAC1)在P110kg部分中检测不到或仅微弱存在。

EV标记蛋白在人类样本P110kg部分的类似富集。

透射电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和低温电子断层扫描显示，人类和小鼠组织中P110kg部分中囊泡的形态和大小分布相似。

上面提到的几种实验都是鉴定样本中是否存在EVs的常用技术：透射电镜(TEM)，纳米颗粒跟踪分析(NTA)，Marker蛋白印迹法

采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析了从6个人和3个小鼠肺样本中分离的EVs蛋白成分。为了评估来自不同来源的蛋白质组之间的总体相关性，我们比较了不同类型的样本类型(即肺细胞与肺EVs)和物种(即人类EVs与小鼠EVs)。

多种哺乳动物细胞都能够释放EVs，而EVs的分子组成可以反映出它们的原始细胞，而scRNA-seq是一种解剖器官和组织复杂性的强大技术，有助于我们了解细胞多样性和异质性转录表型状态的基础。我们试图利用公共scRNA-seq数据和我们的LC-MS/MS结果来确定EVs的来源，遵循如图所示的过程：

简单地说，在获得了肺细胞的scRNA-seq数据和肺EVs的蛋白质组学数据后，我们评估了肺EVs的蛋白质组成是否能反映其细胞来源。

由于EVs中超过一半的蛋白质在特定的细胞类型中表达，我们根据每个细胞簇的丰度(来自LC-MS/MS数据)和表达水平(来自scRNA-seq数据)计算了每个细胞簇中EVs的比例。最后，我们计算了单细胞释放EVs的能力。

单细胞聚类结果：

来自17,370个人类细胞的15个界限明确的簇和来自3989个小鼠肺细胞的16个簇，包括在肺中发现的常见免疫细胞和非免疫细胞。

我们从人类（补充表1）中选择了583个高丰度EV蛋白，从小鼠（补充表2）中选择了589个，并生成了热图，显示编码EV蛋白的基因在不同的簇中具有不同的表达水平。

这些EVs蛋白在单细胞cluster gene中的情况：至少有一半以上都与细胞特异性高表达基因overlap，表明蛋白质在scRNA-seq数据中的一个或多个聚类中特异性表达。

这些结果表明，肺EVs中的蛋白质可以反映其细胞来源，这对后续的分析具有重要意义。

图中百分比计算方式：

然后使用蛋白质谱分析来评估单个细胞释放EVs的个体能力。对于人类样本，我们发现单个成纤维细胞释放的EVs最多(图3e)，而ATI细胞从小鼠样本中释放的EVs最多(图3f)。

与单个免疫细胞相比，从单个非免疫细胞中获得了更多的 EVs：

对多种人和小鼠细胞系培养上清液中 EVs的定量分析显示了相似的结果。

GSEA分析显示：与所有免疫细胞相比，所有非免疫细胞中EVs分泌相关基因均显著富集(图3j)。EVs分泌相关基因在非免疫细胞中的表达上调与它们释放EV的能力高于免疫细胞的能力相一致

上述结果表明，我们的分离和高通量检测方法已确定ATII细胞是肺EVs的主要来源，非免疫细胞通常比免疫细胞释放更多的ev（每个细胞）。

接下来的问题：搭载了EVs这个通讯工具的cargos(蛋白质)要运往何处？

EVs通过细胞和器官之间传递货物，导致受体细胞的改变。为了探索肺EVs的生物学功能，我们首先研究了它们的积累位置。

实验设计：

结果：

EVs通讯的几大关键问题与挑战不知大家还记得与否：外泌体多组学05-EV介导的细胞间通讯研究综述( )

实验设计： mRNA sequencing analysis：肺EVs刺激的中性粒细胞 vs untreated 中性粒细胞

结果：

这表明：肺EVs可促进中性粒细胞趋化

根据作者强大的生物背景知识：已知CXCL1和CXCL2有助于急性炎症过程中中性粒细胞动员和招募的早期阶段。

作者前面还对肺EVs做了一个全基因组测序，并将EVs中的 dsDNA引入了 EVs在受体细胞内发挥作用的通路机制解释中（我并不关注EVs中DNA层面的分析，感兴趣的可以去文章看详细内容），最后的通路机制如下：

我在此有个很大的疑问啊：所以EVs中的货物蛋白质在这里只是做了一个溯源？它对受体细胞就没有影响吗？即使作者说了EV衍生的DNA可以通过旁分泌的相互作用来调节肿瘤免疫。

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从上清液中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1 聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加缓冲液冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5 ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体活检中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。

手机上怎么查看核酸检测结果手机上核酸检测结果怎么查

演示机型：华为麦芒9

系统版本：Android10

软件版本：Version 8.0.16

核酸检测结果可以在微信中的防疫健康码进行查看，具体步骤如下：

1、进入微信，点击右下角的【我】，点击【支付】。

2、点击【防疫健康码】，选择自己所在的城市，点击查看防疫健康码。

3、点击【我的核酸检测】，就能看到核酸检测记录，点击相应记录即可查看检测结果。

总结：查看核酸检测结果的具体方法是进入微信的【支付】，进入防疫健康码功能，选择所在的城市点击查，再点击我的核酸检测，选择相应检测记录即可查看检测结果。

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一般的验孕试纸验尿后如果只出现对照线，则表示未孕；如果出现两条线，且检测线颜色浅于对照线，则表示可能怀孕；如果检测线颜色和对照线一样深或者比对照线还深，则表示已经怀孕。

不过传统验孕棒很容易出现结果很难看懂的情况，推荐使用可丽蓝电子验孕笔，验孕结果会以文字形式“已怀孕”或者“未怀孕”提示，而且还能显示怀孕周数。验孕棒正确看法图。

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早早孕测试

怎么判断验孕棒上显示的的结果？

原理就是利用特异性抗原抗体相结合的原理，用胶体金标记抗体，与抗原结合后，在试纸上显示红色。验孕棒显示图。

首先将被检女性尿（晨尿）放入小尿杯中，将早早孕试纸标有的一端中，尿的液面不得越过线。分钟即可观察结果，分钟后结果，一般的早早孕试纸都会附有说明书，请按照说明书的步骤严格执行。

如果仅在白色显示区上端呈现一条红色线，则为结果，即没有；在白色显示区上下呈现两条红色线，则为结果阳性，提示。由于试纸的反应线因标本即中所含浓度多少呈现颜色深浅的变化，此方以检出尿中量为，如果反应线是淡粉色，说明体内浓度不高，可以在几天后重新测试确定。如果试纸条上端无反应线出现，表示试纸失效或测试方法失败，也可能是体内含量不高，周之后月经仍未，你就应该再做一次自测需要注意的是验孕棒一深另一边散开红。

注意包装盒上的生产日期，不要使用过期的测试卡，因为化学药剂时间长了就会失效；如果出现自己不能确定的情况，应该专业；自测结果并不一定是准确无误的，结合自己的情况，如果出现恶心呕吐、疲劳乏力、、15个信号暗示你怀孕了。

发胀、偏食、嗜睡等类似早孕的反应，即使结果为，也应该去医院检查。

3、验孕棒怎么看结果图片:怎么判断验孕棒上显示的的结果？

平时月经规则，推迟2-3天，最多不超过1个星期，可以用验孕棒测是不是怀孕。验孕棒在各大药店都有售比较便宜，买了之后用晨尿检测。

1、同时出现两条红线。

如果在棒上同时出现两条钱，且测试区明显清晰。是呈阳性的表现，表明已怀孕。

2、只有一条红线。验孕试纸一深一浅图解。

仅对照线C处出现一条紫红条带，在测试区T处无条带，是呈，表明未怀孕。测怀孕千万别用大卫。

3、出现一深一浅。可丽蓝怎么分辨水印和怀孕。

在测试区T内的标示较浅，在对照线C的颜色较深，是呈弱阳性的现象，表示有怀孕的可能。

4、验孕棒没有红线。

新验孕棒就算用比较差的2块钱的一般都不会有问题，而如果未出现带，则有可能是你不正确或真有可能是验孕棒有问题。