细胞的复苏冻存传代实验（细胞复苏和冻存的原理）

本文目录一览：

• 1、求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤
• 2、细胞复苏、 换液、传代、 冻存protocol
• 3、细胞培养(换液/传代/冻存/复苏)操作说明
• 4、细胞培养一般方法有哪些

求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤

贴壁细胞冻存实验准备：

将15mL离心管、冻存管、PBS缓冲液、移液管、电动移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒灭菌；

细胞完全培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、细胞冻存液等从4℃冰箱中取出后，复温至室温，备用；程序降温盒复温至室温备用。

贴壁细胞冻存操作步骤：

1. 从培养箱中取出准备冻存的细胞；

2. 显微镜下观察细胞状态并拍照记录；

3. 酒精消毒培养瓶后放入安全柜中；

4. 吸去多余的培养基，加人2~3ml PBS缓冲液润洗一次；

5. 加入1ml胰酶，放入37℃消化；

6. 消化1min左右，在显微镜下观察细胞消化情况；

7. 消化完全后，加3ml完全培养基终止；

8. 将细胞悬液移入15ml离心管中离心，1000rpm/min（约200g）离心3-5min；

9. 吸去多余的液体，向细胞沉淀中加入适量的冻存液，轻轻吸打混匀；

10. 按比例分装至冻存管中；

11. 贴好标签后放入梯度冻存盒中；

12. 将冻存盒放入-80℃，降升姿温过夜后，移入液氮中保存。

注意事项：

1）细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；

2）不同细胞吵手绝消化时间有差异，以实际镜检结果为准，大部分细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可中止消化，消化时薯悔间不宜过长；

3）应选择汇合度80%-90%左右，细胞处于对数生长期时进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；

4）冻存细胞保存温度应低于-130℃，不可在-80℃长期保存。

细胞复苏、 换液、传代、 冻存protocol

复苏

细胞复苏是指将冻存在液氮或-80℃的细胞解冻，恢复其生长的过程。操作原则：快！慢冻速融里的速融就是指细胞复苏过程。

步骤：

1、 准备工作：预热完全培养基。多少℃培养的细胞就预热到多少℃

在生物安全柜/超净工作台中，准备好细胞培养瓶/皿，并在其中添加足量预热的完全培养基。

如果需要离心去除冻存细胞中的冻存液，此时也可以准备好 15ml 离心管，在管中添加1-2ml 预热的完全培养基。

2、 解冻细胞。

做法有 2 种选择：

(1)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速入 37℃水浴，轻摇解冻。冻存管口保持在水面上，以免水浴锅中的水进入管中。

如果冻存细胞的地方离细胞房水浴锅较远，可以准备一个干净的烧杯，烧杯中装 37℃ 水，带着烧杯去取细胞以实现迅速入水浴，或者路上利用体温手搓冻存管到达水浴 时如未充分解冻再投入水浴继续解冻。当冻存管中只剩一点小冰粒时，酒精棉擦拭冻存管外表面凳早，移入生物安全柜/超净工作台。

(2)从-80℃或液氮中取出冻存的细胞，迅速酒精擦拭冻存管外表面，移入生物安全柜/ 超净工作台，向冻存管内加入适量预热的完全培养基，并轻轻吹打以促使细胞融化。这个做法适合冻存管中有足够空间以容纳新加入的新鲜培养基肆贺。自己可以尝试一下，哪种方法细胞融化速度快就用哪种方法。个人认为第 2 种快。

3、 接种细胞：

此时做法有 3 种选择：

(1)如果是对冻存液成分耐受的细胞，可将冻存管中的细胞直接吸入准备好的培养瓶/皿， 轻轻十字摇晃混匀细胞，放入细胞培养箱。

(2)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，将冻存管中的细胞吸入准备好的 15ml 离心管中，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。

(3)如果是对冻存液成分不耐受的细胞，用解冻细胞第 2 种方法的，可以直接用冻存管离心，500g ×3min 离心，去除上清，1ml-2ml 预热的完全培养基重悬细胞沉淀并转移到准备好的培养瓶/皿。

4、 第二天光镜下观察细胞。如果是带着冻存液一起接种的细胞应进行换液。

细胞换液

细胞换液是指去除旧的培养基，换成新的完全培养基以继续提供细胞充足的营养支持。当旧培养基 ph 值改变（含酚红的培养基通常是变酸发黄）时，需要及时进行换液。

步骤：

1、 准备工作：

预热完全培养基，酒精棉擦拭培养基瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开培养基瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

如果是贴壁细胞，可以用全量换液法，直接吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养基。

如果是悬浮细胞，可以用半量换液法，即吸去一半旧培养基，补充新鲜完全培养基。（会损失一半细胞）。悬浮细胞如果不想损失细胞，那就需要将培养物转移到离心管中，离心去除旧培养基，再用新培养基重悬细胞沉淀。

不光细胞维持培养时需要进行细胞换液，一些实验操作也需要进行细胞换液。当换液操作是实验需要时，可能在添加新的培养基前需要 PBS 清洗细胞以去除旧培养基的影响， 新添加的培养基也可根据实验需求进行特殊配制，不一定是完全培养基。

细胞传代 是指将细胞培养物分出来，重新接种到新的培养瓶/皿内，使细胞重新获得足够的生长空间的过程。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行传代。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可裂粗派以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开试剂瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

吸去旧的培养基，DPBS 洗细胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或无动物成分来源的 TryplLE），轻轻晃动培养瓶/皿，使消化液能均匀布满所有细胞。

一些强贴壁的细胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗细胞，并在 37℃进行消化（加上消化液后放进 37℃细胞培养箱）。

用含EDTA 的胰蛋白酶来消化细胞的话，消化速度会更快。

强贴壁细胞或用特殊的无血清培养基培养的细胞使用 TrypLE 消化。

细胞消化的同时可以准备新的培养瓶/皿，往培养瓶/皿中添加适量新鲜培养基。

当镜下观察贴壁细胞直接的连接松散，细胞有所变形，但还没有出现大片脱落时，吸去消化液，稍待一两分钟，让残留在细胞表面但是肉眼看不见的消化液进一步消化。

加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞（用一层层“扫描”方式来吹打），不要忘了沿边“清扫”。胰蛋白酶可以被完全培养基中含的血清终止。

EDTA 无法被终止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的细胞，可以在加完全培养基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。

TrypLE 无需终止，DPBS 稀释即可，因此也可以在加完全培养基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。

最好控制不要消化过度，细胞成片脱落。当细胞消化过度时，只能通过离心去除消化液了。

吹打细胞时注意轻柔，控制泡沫，以免对细胞造成太多的细胞损伤。吸不净，吹不净， 枪尖始终保持在液体中可以有效控制泡沫产生。

在加入新培养基吹打细胞时即可规划好，打算一盘细胞分成 N 盘，那就用 0.5N/1N ml 培养基进行细胞吹打。

将细胞吹打成细胞悬液后即可每个新瓶/皿接种 0.5 或 1ml，十字混匀后，送入细胞培养箱继续培养。

通常细胞可以 1:2、1:3、1:4 传。有些细胞不能传太稀，容易状态不好生长缓慢。

对悬浮细胞而言，因为不需要消化，传代过程比较简单，直接吸取一定量旧培养物接种到新培养瓶/皿即可。

细胞冻存 主要为了细胞保种，是指将细胞置于保护性液体中于低温中长期储存的技术。

对单层生长的 贴壁细胞 而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行冻存。

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂、DMSO 或无血清细胞冻存液，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。准备无菌细胞冻存管和 15ml 离心管，移入生物安全柜/超净工作台。

准备程序冻存盒（恢复至室温）。如果使用添加异丙醇的程序冻存盒，注意异丙醇的量， 如不足，需添加，并且应该根据程序冻存盒说明书定期更换异丙醇。

按细胞传代的做法进行细胞消化，吸去消化液后，1-2ml 完全培养基吹打成单细胞悬液。对悬浮细胞而言，无需消化，直接进入下一步离心收集细胞。

将单细胞悬液转移到 15ml 离心管，500g×3min 离心，去除上清。

如使用无血清细胞冻存液，直接吸取无血清细胞冻存液重悬细胞，然后转移到冻存管中拧紧盖子。

如使用自制的细胞冻存液，需要先配制好细胞冻存液，方法如下：

优先使用培养该细胞的新鲜完全培养基配制，900ul 完全培养基+100ul DMSO=1ml 细胞冻存液（DMSO 含量 10%）。

DMSO 在加入培养基时会发热，务必提前配制好冻存液，以免过热损伤细胞。

对于娇弱的细胞，可配成 2×细胞冻存液，先使用一定体积新鲜完全培养基重悬细胞，再逐滴滴加等体积 2×细胞冻存液（DMSO 终浓度还是 10%），吹打混匀，转移到冻存管中。

自制细胞冻存液中的 DMSO 可适当降低，5%-10%都可以，胎牛血清可以提高至 20%。

在冻存一些比较娇弱的原代细胞时，冻存液中的完全培养基可以用胎牛血清替代，即冻存液中只含胎牛血清和DMSO。

冻存细胞的量可以参考传代时的比例，原则是让复苏的细胞有充足的生长空间。推荐使用内旋式细胞冻存管，比较安全。

有些细胞冻存管的管盖设计是特殊的，当第一次感觉拧紧时，此时并没有真正拧紧，可以进一步拧，直到第二次感觉到拧紧。推荐使用这样的冻存管，在温度变化发生热胀冷缩时不容易发生液体泄漏，减少污染的可能性。

使用无血清冻存液重悬的细胞，无需程序降温，直接塞-80℃冰箱降温，第二天转移到液氮中。

使用自配细胞冻存液的细胞，需放进程序冻存盒后再置于-80℃冰箱中，第二天转移到液氮中。

-80℃不适合长期保存冻存细胞（大概 1-2 年吧）。液氮中冻存的细胞十年之久都可以复苏成功。如需要更长期地保存细胞，应该定期复苏细胞后再次冻存。

程序冻存盒也可以自制，即使用大量脱脂棉花包裹冻存的细胞，或使用海绵包裹细胞。

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细胞培养(换液/传代/冻存/复苏)操作说明

所需试剂

细胞完全培养基：★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 细胞处理后的第二天，在显微镜下观察细胞状态，如死细胞较多且细胞密度较低，需要进行换液操作。

  （1）悬浮细胞请在高倍镜下观察，一般而言，活细胞轮廓圆润、界限清晰、透明度大、折光性强。如细胞活率较高，则继续正常培养。

  （2）贴壁细胞如观察到较多细胞漂浮，请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是死细胞还是暂未贴壁的活细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

  （3）半贴壁细胞正常培养会有部分细胞漂浮，属正常现象。请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是否是死细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

2. 如需换液，参考以下步骤：

 （1）悬浮细胞：收集培养容器中的所有细胞悬液。250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，将细胞悬液接种到合适的培养容器中。

 （2）贴壁细胞：直接弃去培养容器中的上清，添加预热的完全培养基至原培养容器中。

 （3）半贴壁细胞：收集培养容器上清中的所有细胞，250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，接种至原培养容器中。

3. 之后，每2~3天更换一次完全培养基，后续根据细胞生长密度和状态传代或冻存。

  注意: 若发现异常情况，应及时排查原因，并与我们联系。

所需试剂

细胞完全培养基

贴壁和半贴壁细胞需要同时准备以下试剂：

0.25% Trypsin-0.04% EDTA（货号: GUTP-R001，以下简称胰酶）

1×PBS（货号: GUPB-R001，以下简称PBS）

1. 预热完全培养基（贴壁和半贴壁细胞还需要预热胰酶和PBS）。

2. 细胞收集。

 （1）悬浮细胞直接收集培养容器中的所有细胞悬液至离心管中。

 （2）贴壁/半贴壁细胞需要对细胞进行消化处理，步骤如下：

         ① 用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔，清洗全面。

         贴壁细胞直接弃去培养容器中的培养上清。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS直接弃去，无需保留。

         半贴壁细胞需收集培养容器中的培养上清至离心管中。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS需收集至离心管中。

        ② 加入胰酶，迅速铺匀，确保其充分接触细胞表面。

        ③ 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基，轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

        ④ 吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。将细胞悬液转移至离心管中。

3. PBS洗涤培养容器1~2次，收集所有细胞悬液至离心管中。

4. 收集的所有细胞悬液250 g离心4 min。

5. 离心后去除上清。加入2 mL预热的完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

6. 将细胞按(2.5~4.0) ×10^4个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。

注意:  如未计数，也可按照适宜比例进行传代，但请根据细胞实际生长情况灵活调整传代比例。

7. 摇匀细胞，将培养容器放入细胞培养箱中。

8. 后续根据细胞生长密度和状蚂型链态进行补液（悬浮细胞）/换液（贴壁/半贴壁细胞）、传   代或冻存等操作。

所需试剂

冻存液

★ 推荐使用海星HyCyte™一步冻存液（即用型、无血清、无需程序降温）

1. 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2. 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细闷孙胞按比例或数量分装至冻 存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×10^6个/mL。

 注意: 细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请 将细胞放置于租乎4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

    注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

所需试剂

细胞完全培养基

★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 开启37℃水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于-80℃冰箱，让冻存管中液氮挥发。

2. 洁净工作台内准备15 mL离心管，加入5 mL预热的完全培养基。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。

    注意: ① 融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。

             ② 管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次， 转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次，一并收集至离心管内。

5. 250 g离心4 min。离心后去除上清。加入2 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分 吹散、混匀。（如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数）

6. 将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，加入足量完全培养基， 摇匀细胞，将培养容器放入培养箱中培养。

7. 复苏次日，观察细胞状态并换液，具体操作见”细胞换液”。

    注意: 贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动，具体注 意事项见相应细胞说明书。

细胞处理原则

·  严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台/生物安全柜和培养箱的清洁。

·  规范的操作方式。请按照操作说明描述的方式操作，注意操作细节。

·  需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。使用的试剂必须经验证可靠，适宜细胞生长且批间差异小。

细胞培养一般方法有哪些

细胞培养首先尘袜激分为原代培养和传代培养.

一、原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞,然后继续进行传代、冻存；

二、传代培养首先进行细胞复苏:

1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.

2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养瓶内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养,24h后换液；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,完全培养基重悬培养,适时换液.

细胞传代:

1.贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死细胞,50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,新鲜培养基重悬沉淀,加入完全培养基后继续培养或实验.

2.悬浮细胞:

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度或需更换好扮新培养基,可先离心（1000rpm,5min左右）后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其派袜它培养瓶内加入完全培养基继续培养.