pkh67外泌体染色原理（pkh26 外泌体）

本文目录一览：

• 1、细胞外泌体是什么？
• 2、Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移
• 3、microRNA与血管通透性转移研究套路

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研乎衫没究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎塌吵牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验岁纳时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移

前言

肝细胞癌（HCC）是世界上第五大常见癌症，以及全球癌症死亡的第五大原因。大部分HCC患者出现转移，其中肺转移的总体生存率约5.9月，无转移患者总体生存率约16.2月。肺转移在恶性肿瘤中的发病率约25%-30%，HCC患者发病率约41.6%-43.6%。

肿瘤细胞与相应微环境的相互作用以及基质细胞参与肿瘤进展的重要性。肿瘤的基质细胞有内皮细胞，纤维母细胞，肿瘤浸润的炎症细胞，这些细胞创造微环境，改善肿瘤细胞的特蚂猛此性，调控肿瘤的发展及对治疗的应答。研究表明，肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）可以加速肿瘤的发生、发展。巨噬细胞根据极化特性分为M1和M2型，M1型巨噬细胞能够分泌促炎症和免疫刺激因子，TAMs比较接近M2型巨噬细胞，可以激活产生Th2细胞因子。TAMs加速癌细胞转移以及癌细胞与TAMs对话的潜在机制有待进一步阐明。

外泌体是一种包含蛋白、核酸、脂质的微小囊泡，参与肿瘤微环境中不同类型细胞间的物质运输、信息传递。由于TAMs外泌体与肿瘤的研究是有限的，所以TAMs外泌体对肿瘤的发生发展和转移也需要进一步探索。

最近发表于Hepatology杂志（IF=14.679）的研究指出，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来源的外泌体介导CD11b/CD18蛋白转移到肿瘤细胞，可能增强了肝癌细胞迁移能力，为肿瘤转移机制提供新的见解。

◆ 技术路线 ◆

在这项研究中，研究人员获取120例肝癌vs. 癌旁，转移vs. 非转移临床样本，CD206、CD68在肝癌和HCC非转移组织样本中表达显著升高，且CD206、CD68高表达患者预后较差。

功能上，M2型巨噬细胞/M2型巨噬细胞条件培养基与肝癌细胞共培养，促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

PKH26染色示踪肝癌细胞吞噬外泌体效率；M2型巨噬细胞来源外泌体（M1 exos）介导肝癌细胞迁移和侵袭；GW4869（外泌体抑制剂）知笑逆转迁移和侵袭表型。

体内实验表明，巨噬细胞来源外泌体预处理肝癌细胞，尾静脉接种到小鼠。与对照、M1 exos相比，M2 exos组肺转移显著增强；GW4869可以逆转体内肺转移表型。另外，M2 exos组总体生存时间也显著降低。M2 exos增强HCC细胞侵袭能力，可能是巨噬细胞和肝癌细胞之间的一种新的信息传递模型。

蛋白质组学测序：M2 exos 组显著上调的蛋白有：FGL2，FABP4, CD37, ITGB2 (CD18 or β2 integrin), ITGB5, and ITGAM (CD11b or αM integrin)。体内和体外研究结果表明，CD18 、CD11b在M2 exo中高表达，可通过M2 exo传递到HCC细胞；CD18 、CD11b抗体阻断后迁移和侵袭能力也下调，小鼠存活时间延长。

前期研究结果表明，在肿瘤发生的初期，MMPs降解胞外基质介导肿瘤的侵袭和转移。研究者通过WB、qPCR、ELISA实验发现M2 exo处理的肝癌细胞中MMP-9表达上调，CD18 、CD11b抗体阻断后MMP-9表达量下调；MMP抑制剂（MMPi）或联合M2 exo处理肝癌细胞，其迁移和侵闷迅袭力下降；另外MMPi处理的肝癌细胞接种小鼠，肺转移数目显著降低。

总之，本研究阐明了M2 exo传递αMβ2到肝癌细胞，激活受体细胞表达MMP9，从而促进肝癌转移。

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microRNA与血管通透性转移研究套路

Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis，if=27.407  Cancer Cell.  2014 Apr 14;25(4):501-15. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.00

microRNA可以被肿瘤细胞以外泌体的形式分泌出来，可以与周边的细胞进行crosstalk，进而起到远程调控的作用。可进行crosstalk的周边细胞种类包括：肿瘤微环境中纤维细胞、血管内皮细胞、同类肿瘤细胞等等。本文题目来看，是肿瘤分泌mir-105，作用于远处血管内皮细胞，调节血管内皮细胞屏障功能，而血管内皮屏障作用是肿瘤转移的一个步骤。两个基本内容mir105调节靶基因和肿瘤转移都是很基础的概念，为何能发表于cancer cell这种27分的杂志上穗饥蠢呢？

首先利用研究exosome的方法，证实肿瘤细胞可以分泌exosome，利用检测方法检测exosome内mir-105表达量增高。exosome的研究方法包括：提取分离的方法、电镜观察法、exosome表面特定标志物western检测；microRNA的pcr检测方法。然后验证外泌体内miR-105的生物学功能，需要将肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养，观察血管内皮细胞的连接方式变化；制作乳腺癌动物模型，观察肿瘤转移数目和取血管内皮细胞观察连接方式改变；检测乳腺癌患者血清内miR-105表达水平，观察转移评价指标（DFS）。最后对miR-105调节的靶基因进行验证，靶基因通过网站筛选、双荧光素酶实验验证，验证的靶基因具有调节猜陪血管内皮细胞连接方式的生物学功能；可以行靶基因的rescue实验，证实miR-105调节的充要条件。

首先观察转移性肿瘤细胞和非转移性肿瘤细胞分泌的exosome功能学差异。转移性乳腺癌细胞 MDA-MB-231、乳腺上皮细胞MCF-10A。超速离心法分离exosome，电镜下观察。因为主要证明其与血管内皮细胞的关系，所以通过荧光染色验证人类微血管内皮细胞（HMVECs）可以摄取肿瘤细胞分泌的exosome。荧光电镜和流式细胞仪两种方法检测证实。transwell检测接受exosome后的HMVECs迁移功能的变化。结果显示：转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome，可以被HMVECs摄取，进而影响内皮细胞的迁移功能。那么exosome中哪种成分才是调节迁移的主要分子呢？

通过Solexa深度测序的方法检测转移性exosome和非转移性exosome中microRNA的表达差异，发现基本相同，也列表显示出差异microRNA表。但是最终还是选择了mir-105，而且据说还靶向TJP1：tight junction protein 1紧密连接蛋白（OZ1）。没有交代选择miR-105的标准，一般选差异最明显，作者只是说：we further focused on mir-105。之后选取数十种乳腺癌细胞系，有的是原发肿瘤细胞系，有的是乳腺癌胸腔积液分离出来的转移性细胞系。分别检测的原发瘤细胞和转移细胞系细胞内和exosome中miR-105的表达水平，发现不论是细胞内还是exosome中，在转移性细胞系中miR-105都高表达，提示miR-105是乳腺癌转移特异相关。

进一步验证转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome可以将miR-105转入内皮细胞。分别将MDA-MB-231和MCF-10A分泌的exosome与HMVECs共培养，分别利用PKH67和Cy3标记exosome和miR-105，荧光显微镜下观察不同染色的定位情况。最终证实MDA-MB-231分泌的exosome中miR-105可以转移至HMVECs中，而不是exosome刺激HMVECs产生大量miR-105.

前期的exosome分泌、转移肢伍内容证实之后，下面就对miR-105影响内皮细胞的功能进行深入研究，或者说miR-105调节的靶基因和生物学功能深入研究。我会先做一些生物学功能实验：干扰内皮细胞miR-105表达水平，观察迁移侵袭的变化；如果HMVECs培养能形成微血管，甚至可以观察微血管内皮细胞间距的变化。然后荧光素酶验证靶基因。

首先双荧光素酶实验，验证miR-105可以靶向抑制TJP1基因，之后再在内皮细胞水平，转染miR-105之后，观察内皮细胞OZ-1 mRNA和蛋白的表达抑制。该实验干预内皮细胞内mir -105表达方法，不是使用siRNA或者miR-up等合成化合物，而是直接使用MDA-MB-231分泌的exosome，以及其他各种对照（MCF-10A），还涉及了rescue实验。总之证实了miR-105可以靶向抑制内皮细胞ZO-1蛋白的表达。以下内容为更专业的研究内皮细胞连接的方法。

1、培养基中内皮细胞连接成片，细胞间有细胞连接体。通过免疫染色ZO-1、OOccludin和E-caderin等细胞连接体，后免疫荧光电镜观察这些连接体的表达变化情况。

2、HMVECs细胞间通透性检测，permeablity assay：了解内皮屏障变化的直接效果，利用transwell小室，内皮细胞培养形成平铺一层内皮细胞膜，上层加罗丹明染料颗粒，后可以利用exosome调节内皮细胞的连接松紧程度，观察转入下层的罗丹明颗粒数量。甚至可以测量内皮细胞通透性阻抗electrical Resistance。除了观察罗丹明，还可以GFP标记MDA-MB-231癌细胞，观察癌细胞迁移数目的变化。

3、3D vascular sprout assay，3D培养内皮细胞，形成微血管树，然后给予exosome后，观察测量微血管树的变化，评估exosome对微血管的影响。

除了阐述miR-105的上述生物学功能，更重要的是证实ZO-1是介导miR-105生物学功能的充要条件，需要设计rescue实验，证明恢复ZO-1后，可以逆转miR-105的生物学功能改变。这部分内容不需要单独列出，在阐述mi-105的功能学变化过程中，多加入一组rescue组别即可，因为最终检测的biomarker都是一样的。

以下内容为动物模型水平，验证miR-105的生物学功能。

动物选取NOD/SCID/IL2Rγ null mice，用miR-105含量不同的exosome注射尾静脉处理干预，（exosome from MCF10A/vec (low-miR-105), MCF-10A/miR-105 (high-miR-105), or MDA-MB-231 cells (high-miR-105), or PBS as control）。 动物模型如何评估血管通透性和肿瘤转移性。

动物模型静脉注射染料罗丹明，观察肿瘤常见转移器官肺和脑组织中罗丹明渗透情况，如果肺或脑组织中罗丹明染料增多，提示血管通透性增加。

动物模型，评估肿瘤转移性，最常见的指标是转移瘤数目或大小。而本文则将移植瘤细胞首先利用荧光标记，然后在心内注射形成移植瘤，3周之后，提取肺和脑组织中荧光基因的表达量，表达量越高提示转移瘤负荷越大。

当然，肝肺组织病理切片，含量不同miR-105处理干预之后，免疫荧光染色观察OZ-1及occludin等细胞连接蛋白表达情况也可间接说明问题。（CD31染色提示血管结构，观察血管结构内OZ-1连接蛋白表达降低）。

之前都是利用mir-105含量不同的exosome做干预，观察血管通透性和转移瘤负荷。那么原发瘤中miR-105高表达后，是否能起到同样的作用呢？首先制作高表达miR-105的移植瘤模型，选取 an MCF-10A-derived tumorigenic line, MCFDCIS, which forms lesions similar to comedo ductal carcinoma in situ that spontaneously progress to invasive tumors为细胞模型，检测细胞miR-105表达含量、细胞内ZO-1表达水平，以及细胞的迁移和转移属性，证实模型成功。之后同上一部分，检测罗丹明染料评估血管通透性、检测荧光基因评估转移瘤负荷，以及病理切片ZO-1染色。结果证实原发瘤高表达miR-105，同样可以抑制肺脑组织ZO-1表达、增加血管内皮通透性、促进肿瘤转移。

为了证实，miR-105抑制剂能否逆转上述生物学功能变化，具有治疗意义。动物模型制备同上一部分，干预处理措施为：尾静脉注射anti-mir-105，检测指标同上。结果显示anti--miR-105具有治疗意义。

检测瘤组织和血清mir-105表达水平，是否具有一致性，以及miR-105与ZO-1具有负相关，回顾性分析转移瘤和未转移瘤患者血清miR-105表达水平，高表达者发生转移率更高。或者生存分析预后。

microRNA研究套路：细胞生物学功能、靶基因验证及介导功能的必要性、动物模型试验，最后在临床病例寻找证据，支持机制研究结论。这是基础研究的逻辑方式，首先在分子机制研究透彻了，然后找临床数据支持。而临床研究逻辑则相反：首先发现有临床现象和临床数据支持，然后在深入探讨细胞和动物水平有没有该现象，如果有的话，最后深入探讨分子基因互作机制。另外研究血管通透性相关转移，可以参考该文的实验方法。•

参考资料：

NOD/SCID/IL2γ null mouse：

 NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。

• Prkdcscid ：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T和B细胞缺失 ，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。

• Il2rgnull： Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。

B- NSG 小鼠 ：综合了NOD-SCID-IL2rg背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。

优点

• 迄今世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠；

• 与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年；

• 对人源细胞和组织几乎没有排斥反应；

• 少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型；