细胞复苏的注意事项（细胞复苏要点）

本文目录一览：

• 1、细胞的冻存与复苏要注意什么 – 手机爱问
• 2、细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
• 3、细胞复苏时候一定要离心吗
• 4、和注意事项细胞复苏如何进行，有哪些需要注意的事
• 5、细胞冻存的7个注意事项

细胞的冻存与复苏要注意什么 – 手机爱问

细胞冻存与复苏步骤注意事项

一、原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。悉培

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金樱掘属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用睁颂唯1～1.5月。

（二）复苏

1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2. 培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。

3. 二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。

4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

7. 记录复苏日期。

【注意事项】

1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。

5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

具体步骤：

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。

加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证枝悉姿温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要求：

1．无菌环境

无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。

3.适宜的渗透压

高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。

4．气体环境与pH

细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。

注意事项：

（1）第一次开始培养某种细胞时，一定要在WWW. ATCC. ORG上用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。

（2）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照步骤操作。

（3）预防细胞污染

（4）防止细胞交叉污染

扩展资料：

动物细胞培养：

在所有的细胞离体培养陆告中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。

⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最猛绝常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。

⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。

参考资料：细胞培养-百度百科

细胞复苏时候一定要离心吗

细胞复苏时候一定要离心，否则会造成实验失败。细胞复苏，生宽陪物学的一种术语，是指将冻存逗察在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。

细胞（英文名：cell）并没有统一的定义，比较普遍的提法是：细胞是生物体基本的结构和功能单位。已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，但病毒慎指蠢生命活动也必须在细胞中才能体现。

和注意事项细胞复苏如何进行，有哪些需要注意的事

一、\x09复苏

1.\x09把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动.液体都融化后（大概1-1.5分钟）,拿出来喷点酒精放到超净工作台里.

2.\x09把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一游空遍,把粘在壁上的细胞都洗下来）,1000转离心5分钟.

3.\x09把上清液倒掉,加1ml培养基把细胞悬浮起来.吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动,使培养皿中的细胞均匀分布.

4.\x09标好细胞种类和日期、培养人名字等,放到CO2培养箱中培养,细胞贴壁后换培养基.

5.\x093天换一次培养基.

二、\x09传代

1.\x09培养皿中燃磨此的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代.

2.\x09把原有培养基吸掉.

3.\x09加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行）,消化1-2分钟.

4.\x09细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化.

5.\x09用移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来.

6.\x09把细胞吸到15ml的离心管中,1000转离心5分钟.

7.\x09倒掉上清液,加1-2ml培养基,把细胞都吹起来.

8.\x09根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中.一般,癌细胞分5个,正常细胞传3个.继续培养.

三、\x09 冻存

把细胞消化下来并皮迅离心（同上）.用配好的冻存液把细胞悬浮起来,分装到灭菌的冻存管中,静止几分钟,写明细胞种类,冻存日期.4℃ 30min,-20℃ 30min,-80℃过夜,然后放到液氮灌中保存.

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,边滴边摇.

要注意的就是无菌操作!

细胞冻存的7个注意事项

一、细胞冻存

方法：

冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7） 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，

对于贴壁细胞：

1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次

2胰酶消化

3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止

4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）

5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度含基过夜，再放液氮长期保存

悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤

注意事项：

错误的时机：

细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已 经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。

解决：

最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。

2.细胞太少：

冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。

解决：

离心后调整细胞浓度。唤裤（不要重新洗细胞）。

3.盖子不紧：

冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。

解决：

选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。

4.单薄的冻存盒：

放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。

解决：

选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）

5.-80度太久：

放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）

解决：

尽快转入液氮。

6.液氮不足：

液面不能漫过所有细谈链谨胞

解决：

定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

7.取错细胞：

找不到/拿错冻存管。

解决：

每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。

二、细胞复苏：

方法：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

离心， 1000rpm，5min；

弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

次日更换一次培养液，继续培养。

注意事项：

取错细胞：

拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）

解决：

（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。

（2）拿细胞时戴手套！

2.水浴时间太长：

2min还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）

解决：

（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。

（2）要是冬天，就选用保温盒。

3.冰盒内时间太长：

复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）

解决： 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

4.失去耐心：

复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）

解决： 不要换液，耐心等待，两周后再做决定。