天津外泌体检测（外泌体的检测方法）

本文目录一览：

• 1、关于外泌体?
• 2、外泌体提取策略
• 3、什么是外泌体？
• 4、第一次去天津中心妇产医院看不孕，第一次去都会检查哪些项目
• 5、提取组织中的rna，会把外泌体中的rna也提出来了吗

关于外泌体?

1、新鲜细胞的再生。外泌体可以使用到受损部位，激活干细胞，促进皮肤细胞新生

2、修复受损细胞。修复受损皮肤细胞，并且储存在皮肤组织中，通过调节皮肤微环境，起到生理修复的效果，而且效果更安全有效

3、防止氧化。外泌体可以激活培芹抗氧化系统，促进抗氧化物质的增加，达到全面抗氧化、保护皮肤的目的。

4、免疫调节。外泌体能抗炎、调节皮肤微环境，还能能调节免疫、促进细胞迁移等，起到改善细胞功能、抗炎、维持组织微环境平衡的作用。外泌体中含有丰富的人体细胞生长因子以及蛋白质，轿基可以激活细胞，从而达到闭中谨皮肤抗衰老的目的。

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简孙纳卜称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法茄吵,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改则穗良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。 

什么是外泌体？

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多基败种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

所有培养的细胞类型均可分泌外搏燃泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、搏银颤脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

第一次去天津中心妇产医院看不孕，第一次去都会检查哪些项目

壹、[推荐]孕媒教授王景安谈男性不育的系统检查

男性不育的九大项系统检查

婚后性生活正常，未采用任何避孕措施而2年内不怀孕者称不孕。调查资料表明，不孕原因中，在我国男方占20—30％，女方占60—70％，双方共同原因者10％左右，近年来男性原因不孕呈上升趋势。

婚后一直同居未有小孩者，若妻子经检查没问题，男方应该及时去医院检查，以便查出原因，及早治疗，可在医院泌尿科或男性科最好是不孕不育专科依次进行如下各项检查。

一、病史

正确采集病史很重要，患者要积极主动配合，如实反映以下情况：

1、职业与工种：有无接触毒物（铅、汞、磷）、放射线，是否高温作业，接触时间以及有无防护措施；营养状况；有无不良嗜好（烟、酒）等。。

2、既往病史：是否患过淋病、腮腺炎、结核、附睾炎、前列腺炎、肾盂肾炎、膀胱炎或脊髓损伤，有无排尿困难，有无糖尿病或甲状腺机能减退等，治疗情况及效果如何。

3、婚姻及性生活情况：包括对性生活的态度，性交情况与频度，有无遗精、阳痿、早泄等，婚前有无自慰习惯；夫妻感情如何，妻子的健康情况，性生活是否协调等；结婚年限、同居时间及是否采取过避孕措施。

4、既往检查与治疗情况：男方精液检查结果、采集时间与方法；曾否治疗，效果如何；女方检查的情况。

5、家族史：家族中有无不育症、两性畸形、遗传病、结核病等患者。

二、体格检查

包括全身及生殖器官检查。全身检查与内科方法相同，特别要注意发育、营养及精神状况，但重点则是生殖器官的检查，检查内容包括：

1、阴茎：注意有无严重的包茎、硬结、炎症、肿瘤或发育异常。

2、尿道；有无瘘孔、下裂、硬结等。

3、前列腺：经肛诊可检查其大小，有无硬结、肿物，还可按摩取前列腺液检查。

4、睾丸：测量其大小、触诊硬度，有无硬结、压痛、肿物，是否为隐睾。

5、精索：触摸其中输精管的硬度，有无结节、压痛，有无精索静脉曲张。

三、实验室检查

除将精液检查列为必查项目外，其余要视患者具体情况进行选择：

1、精液分析：此举有助于了解男性生育力，是男性不育症的必查项且，检查内容包括色、量、液化时间、酸碱度、精子计数、活动力、存活率及形态。

2、体外异种授精实验：即使常规精液分析完全正常，但有时仍不能完全代表精子的授精能力。体外异种授精实验可更准确地估计精子的受精能力，对判断男子生育力极具价值，常用者是人精子穿透仓鼠卵子的异种授精实验，以正常生育者的精子作为对照。

3、前列腺液检查：正常为乳白色、偏碱性，高倍镜下可见满视野的微小、折光的卵磷脂颗粒，少许上皮细胞、淀粉样体及精子，白细胞数小于10/HP，有炎症时白细胞数目增加，甚或见到成堆脓细胞，卵磷脂颗粒显著减少。

四、内分泌检查。通过促性腺激素释放激哪尺手素等检查可以了解下丘脑——垂体——睾丸轴的功能。测定睾酮水平可以直接反应间质细胞的功能。如有必要可测定甲状腺激素、肾上腺皮脂激素或泌乳素。

五、多普勒超声检查。

六、X线检查。为确定输精管道的梗阻部位，可采用输精管、附睾造影，输精管、精囊造影或尿道造影等，高泌乳素血症者摄蝶鞍X线断层片（正、侧位）以确定有无垂体腺瘤。

七、免疫学检查。通过精子凝集试验或制动试验检测血清或精浆中的精子凝集抗体或制动抗体。检测方法有多种，应因地制宜选用。

八、睾丸活检。用于无精子或少精子症，直接检查睾丸曲细精管的生精功能及间质细胞的发育情况，局部激素的合成与代谢可经免疫组化染色反映出来。

九、染色体核型分析。用于外生殖器官畸形、睾丸发育不良以及原因不明的无精子症。

怀孕是一项系统工程，与男方、女方以及双方之间的多种因素相关，建议您去正规医院专业科室做系统检测治疗。这样可以少走弯路，以便早日怀孕！

贰、女性不孕该做什么检查？

每个医院的检查项目不可能一致的，会有差异的，费用也有所不同。

女性不孕检查—系统检查除全身检查以外，还应当做生殖系统检查。那么，到底有哪些检困物查必须做呢？可以提前大概了解一下做到有备无患。

（1）女性不孕检查—系统检查除全身检查以外，还应当做生殖系统检查。除了一般视诊、触诊外，还要做阴道窥镜检查及内诊（双合诊或是三合诊），初步了解阴道、子宫、宫颈、输卵管、卵巢及盆腔的大致情况，例如子宫的大李嫌小、位置是否正常，输卵管、子宫、卵巢有无肿块、压痛，子宫有无抬举痛，附件的活动度等。

（2）女性不孕检查—推测有无排卵及预测排卵期：可以通过B超、基础体温测定以及宫颈粘液检查或激素测定来判断。

（3）女性不孕检查—子宫内膜检查：必要的时候通过活检了解子宫内膜的功能状态，而且经项检查又是了解有无排卵或是黄体功能状态的可靠方法，与此同时还可以了解宫腔的大小，排除宫腔病变，如结核、子宫肌瘤等。

（4）女性不孕检查—内分泌功能测定：例如在月经周期的不同时间做血清雌激素、孕激素水平的测定，以了解卵巢功能的情况；测定基础代谢率，以了解甲状腺功能；进行肾上腺功能检查以及血清泌乳素测定等。

（5）女性不孕检查—输卵管通畅检查：包括输卵管通气或者是通液检查和子宫输卵管造影，主要了解输卵管通畅与否，以及子宫输卵管发育是否正常，有无畸形等。对于输卵管欠通畅者（如轻度粘连）兼有治疗作用。

（6）女性不孕检查—免疫学检查：有一些不孕症与体内存在抗精子抗体有关，所以有时还需进行有关的免疫学检查。了解有无抗精子抗体存在，除了进行抗精子抗体测定外，还可以通过性交后试验、体外精子穿透试验等间接了解之。

（7）女性不孕检查—颅脑部（蝶鞍部）X线检查：了解垂体是否有肿瘤或者是其他病变。

（8）女性不孕检查—染色体检查。

贰、一般来说,受孕应保证以下五个基本条件：

1）.成熟而正常的精子和卵子；

2）.通畅的生殖道；

3）.有适宜的孕育环境，有正常的宫腔和正常的子宫内膜，子宫内膜的变化，要适合受精卵的种植；

4）.适宜的精卵结合时机。正常人射精后，精子进入子宫腔内约能存活2~3天，但其生育能力仅能保持1~2天。未进入子宫腔而滞留在阴道内的精子，其存活时间则不会超过1天。原则上每月只有一侧卵巢产生1个卵子，排出后很快进入输卵管准备受精，若遇不上精子，则在12~24小时就失去受孕能力！

5）.要有一定的生物化学基础，精子和卵子结合前要发生一系列生物化学变化(这是最复杂而最重要的)，如果这些变化正常才能保证精子与卵子的机缘结合！

以上五个基本条件，是自然受孕的必备条件，假如其中一个环节出了故障，夫妻即使有极其恩爱的感情，也无济于事。不孕夫妇要想恢复生育力，必须在医生的指导下(医生的思路或考虑途径：1.男方原因；2.女方原因；3.双方之间的原因。)，从这五个方面去找出故障所在，才有怀胎的希望！

叁、如果急于怀孕生育的话，建议您来我院用改良辅助生育技术，这种新技术把试管婴儿的流程简化了，直接把处理获能好的特定数量精子移植入排卵期妇女特定时刻的输卵管特定部位内，与试管婴儿技术中的“配子输卵管内移植术”类似。程序简化、优化，受孕环境更接近自然生理，更符合自然规律，孕囊着床率反而大大提高了。请百度搜索“配子输卵管内移植术”相关词目，就能理解了……当月成功率过半，大多数都在三四月之内成功怀孕。远远高于人工授精的17%成功率！也高于试管婴儿的37%平均成功率。这样花费较少，速度快，可以尽快解决您们的怀孕生育问题；不论精子多少，活力如何，只要有精子就有解决办法的；精母细胞或者幼稚精细胞甚至未成熟的精细胞也有部分是可行的。

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祝您好孕！

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提取组织中的rna，会把外泌体中的rna也提出来了吗

细胞外的RNA 通常是miRNA了，血浆可此余则做，培养上清也可毁掘以，但RNA的提取需要特殊试剂盒，细胞外RNA通常在外泌体，不过看你森棚要做哪方面的实验，一般来说检测培养上清中的RNA没有太大意义