脂肪细胞外泌体提取（脂质体 外泌体）

本文目录一览：

• 1、脂肪组织巨噬细胞来源的外泌体miRNA可在体内和体外调节胰岛素灵敏度
• 2、面部脂肪填充的原理？
• 3、哪位做过脂肪细胞原代培养
• 4、脂肪细胞核怎么净化？

脂肪组织巨噬细胞来源的外泌体miRNA可在体内和体外调节胰岛素灵敏度

原文链接： Ying et al., 2017, Cell 171, 372–384. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.

这篇文章简单来讲讲的是： 驻留在脂肪组织中的姿闷斗巨噬细胞利用外泌体调节全身胰岛素反应。

文章亮点：

【摘要】

miRNA是一种调节分子，可以被包装在外泌体中从细胞中分泌出去。这里，我们展示了肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞分泌的含有miRNA的外泌体(Exos)给瘦小鼠使用时，可导致瘦小鼠发生葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。相反，从瘦老鼠身上获得的ATM Exos，注射给肥胖小鼠，可改善肥胖小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。 miR-155 是肥胖小鼠ATM Exos中高表达的miRNA之一，更早的研究表明PPAR 是miR-155的靶基因。我们的结果表明，与对照组相比，敲除miR-155的小鼠具有胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。此外，将野生型小鼠的骨髓移植到miR-155敲除小鼠中可以缓和这种表型。综上所述，我们的研究表明ATM Exos中含有miRNA。这些miRNAs可以通过旁分泌或内分泌调节机制被转移到胰岛素靶细胞，对细胞胰岛素反应、胰岛素敏感性和整体葡萄糖稳态具有强大的影响。

引言

胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要病因，肥胖人类胰岛素抵抗最常见的原因。由于全球肥胖率的持续上升，2型糖尿病的患病率也随之上升。人类和啮齿类动物肥胖的特征之一是脂肪组织、肝脏、可能还有骨骼肌的慢性未解决的炎症。这种由肥胖引起的组织炎症反应其中一个引人注目的组成部分是促炎巨噬细胞的积聚，尤其是在脂肪组织和肝脏中。许多早期的研究检测了这种慢性组织炎症状态，并提出促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF-a)，是由组织巨噬细胞分泌的，可直接抑制胰岛素敏感性，是肥胖诱导的胰岛素抵抗的一个潜在病因。然而，抗TNF-a抗体在人类胰岛素抵抗和葡萄糖代谢方面的治疗疗效不显著，提示有其他巨噬细胞分泌因子和免疫细胞因子参与了胰岛素抵抗。最近，花生四烯酸衍生的二十碳三烯白三烯B4通过其特异性受体BLT1发挥作用，被认为是直接降低肝细胞和肌细胞胰岛素信号通路的因素之一。Galectin-3是另一种巨噬细胞分泌因子，既可促进促炎反应，又可通过抑制胰罩带岛素受体信号通路直接阻断胰岛素作用。在这篇文章中，我们报道了ATMs通过分泌含有miRNA的Exos进入循环系统来调节胰岛素作用的新机制。

miRNA与mRNA的结合导致靶mRNA被募集到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，从而导致转录停滞和mRNA的降解。除了这种本身的细胞内作用，miRNA可以以外泌体内含物的形式迹磨被细胞分泌出去，既可以在局部发挥作用，也可以进入血液循环，在远端发挥作用。也有证据表明，这些Exos可以被运输到邻近或遥远的受体细胞，调节受体细胞的功能。这些现象导致我们假设ATMs可分泌外泌体miRNA，作为细胞外分子调节细胞胰岛素作用和系统胰岛素敏感性。

结果

1. ATMs分泌外泌体miRNA

文章第一步先确定ATMs可以分泌包含miRNA的外泌体。

2. 从肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos促进胰岛素抵抗

从肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos会损害三种主要胰岛素靶组织的胰岛素敏感性。

3. 肥胖小鼠ATM-Exosomal miRNAs损害细胞的胰岛素敏感性

肥胖ATM-Exos在体内的作用显著，我们同时对脂肪细胞、肌细胞和肝细胞的进行了相应的体外研究。

4. 来自瘦小鼠的ATM-Exos会降低肥胖引起的胰岛素抵抗

从反面去验证上面实验得到的结果。

5. 肥胖诱导ATM-Exo中miRNA的表达变化

现在开始做机制。

6. MiR-155损害细胞胰岛素信号通路

上一个结果中列举了MiR-155表达的趋势，现在开始做表达差异的功能。

7. ATM-Exo miR-155促进肥胖诱导的胰岛素抵抗

miR-155抑制细胞胰岛素信号转导。

这篇文章先是确定了表型：ATMs可以分泌外泌体，这些外泌体会与胰岛素抵抗相关，胖ATM-Exo会促进胰岛素抵抗，瘦ATM-Exo可以降低肥胖引起的胰岛素抵抗。

然后去探讨为何ATM-Exo可以发挥这样的作用。发现ATM-Exo包含miRNA，瘦ATM-Exo与胖ATM-Exo中miRNA的表达差异显著，肥ATM-Exos中miR-155的丰度明显高于瘦ATM-Exos。选择这个miRNA主要是根据研究经验（也有可能是课题组刚好有这种转基因小鼠）。然后选了miR-155众多靶基因中的一个和胰岛素信号通路相关的靶基因PPAR ，同理选了GLUT4。

最后从正、反、在体、离体等多个角度去show了一些支持猜想的结果。

这篇文章思路简洁，逻辑连贯，但是在过渡到选择靶分子的这一步没有必须性。按照这个差异表达结果其实可以选择那些差异表达的另外某个miRNA去做，说不定也可以做出来相似的结果。

这篇文章的方法部分可以借鉴一些ATMs分离，外泌体分离提纯的方法，还有transwell共培养，骨髓移植等技术之前没接触过，需要按需学习。

原文链接： Ying et al., 2017, Cell 171, 372–384. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.

如果你关注了我，希望你与我一起学习，一起成长！❤

面部脂肪填充的原理？

面部脂肪填充，主要是在美女们的臀部、大腿等位置采集一定的友首脂肪细胞，然后通过加工提纯之后，将脂好迟数肪细胞注射到面部凹陷部位，让面部变得饱旦仿满圆润起来，形象更加年轻好看。

哪位做过脂肪细胞原代培养

方案 23.12 脂肪细胞的原代培养

实验材料

DMEM-ADMEM-B胶原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

试剂、试剂盒

KRBH缓冲液KRBH-A缓冲液

仪器、耗材

Petri培养皿锥形离心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龙滤网尖解剖剪Perry镊塑料箱铡刀移液器

实验步骤

一、切除附睾脂肪垫

1. 在充有 70 % CO2 和 30 % O2 混合气体的塑料箱内麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用铡刀断头放血。

3. 将鼠体在 70 % 乙醇内浸泡一会儿。

4. 尽量在无菌条件下切除附睾脂肪垫。

(a)用一把解剖剪剖开下腹部皮肤，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖开腹膜，然后用 Perry 镊向上牵拉睾丸。

(c)剪取附睾脂肪垫，注意保留血管。

5. 将组织移送到培养实验室。

脂肪细胞的胶原蛋白酶（在 2 ml KRBH 缓冲液加入 20 mg/ml 胶原蛋白酶，然后用 0.22 μm 滤器过滤）消化和洗含咐核涤

6. 将 4 g 脂肪垫（相当于 8 个附睾的脂肪垫）放入盛有 4 ml KRBH 缓冲液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配制 1 L KRBH 缓冲液时，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO4 7H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超净水至 1 L。然后，按 100 ml 分装。使用前加热至 37°C，并将 pH 调整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶内。

7. 将脂肪垫剪成直径约为 2 mm 的组织块。

8. 将组织块放入瓶内，然后加入 1 ml 胶原蛋白酶液。在 37°C 水浴振荡器孵育约 1 h，直至细胞混合物形成乳脂样浓稠液体。

9. 胶原蛋白酶消化后，向瓶内加入 4 ml KRBH 缓冲液（37°C）。

10. 通过搅拌混匀瓶内的细胞，然后用孔径为 250 μm 的尼龙滤网（孔径为 250 μm，放入支持物或漏斗内）将细胞轻轻滤入 50 ml 锥形离心管。

11. 通过向离心管内加入 30 ml KRBH 缓冲液（37°C）洗细胞。用台式离心机短时间离心（ 200 g），然后用吸管吸出下清液。注意脂肪细胞浮在水性缓冲液的上面。

12. 通过加入 40 ml KRBH 缓冲液洗细胞，离心，除去下清液。重复该步骤 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 庆谈掘大霉素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分装，使用前加热至 37°C）（37°C）洗细胞 2 次。

14. 用约 40 % cytocrit DMEM-A 混悬漂浮的细胞。

二、脂肪细胞的原代培养

15. 用 200 μl 大口径吸头将 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 悬液移入 60 mm 培养皿。

16. 将培养皿放入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 的条件下培养 1.5 h 。

17. 向培养皿内加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此时，应进行葡萄糖摄取实验 [ Quom 1998 ]，检査细胞的活力。

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中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443

人前脂肪细胞的原代培养

王竹晨1,刘建中2,李??燕2,杨冬梓1,邝健全1

(中山医科大学??1.孙逸仙纪念医院妇产科,2.生物教研室,广东广州??510120)

摘??要:??目的 建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂简返肪组织增生的生物学特征。??方法 选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照。??结果 培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程。??结论 在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪的前脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础。

关键词:前脂肪细胞;细胞培养;脂肪组织

中图分类号:Q254,R711.75??????文献标识码:A??????文章编号:1000-257X(2001)06-0443-04

PrimaryCultureofHumanPreadipocyte

WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,

SunYat??senUniversityofMedicalSciences,Guangzhou510120,China)

Abstract:??Objective Toestablishaprimaryhumanpreadipocyteculturemethodforbetterunderstandingthepropertiesofhyperplasiaofhumanadiposetissue.??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??likecellsfromadultabdominaladiposetissuewerecultured.Fibroblastsfromadulthumandermiswerealsoculturedtoserveascontrol.??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,proliferativeandhadahighdifferentiationrate.Theirdynamicmorphologicalchanges,growthcurve,extractingstainedintracytoplasmiclipidwithoilredO,allverifiedtheirpreadipocyteidentity.Undercontrolledconditions,thepreadipocytesreplayedtheirhyperplasiaprocessinvitro.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,thereexistpreadipocytesthatcandifferentintomatureadipocytes.Sinceadipocyteisonekindofclassictargetcellstoinsulin,thisstudylaidthebasisforfur??therprobingintoobesityandinsulinresistantdiseasessuchaspolycysticovarysyndrome.

Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue

????脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,与

肥胖及胰岛素抵抗相关疾患如多囊卵巢综合症的

研究关系密切,近年来受到妇科内分泌领域的重

视。前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分

化能力的特异化的前体细胞,它的存在和作用持续

于人的一生,我们从人脂肪组织中培养出了前脂肪

细胞,为进一步研究打下了基础。

????收稿日期:2001-04-23

????基金项目:广东省卫生厅科研基金资助课题(2001189)

????,;1??材料与方法1.1??组织来源选取2000年9月~2001年1月本院妇科内分泌病房行输卵管复通术的正常体重患者。年龄20~40岁,身体健康,无其他急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织及皮肤组织。

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1.2??试验材料

1.2.1??主要试验用品和化学试剂??DMEM/F??12培养基(1!1),无支原体胎牛血清,?型胶原酶,Hepes,人转铁蛋白,青、链霉素原液均购自GIBCO公司;生物素、泛酸盐、氢化可的松,三碘甲状腺原胺酸(T3),3??异丁基??1??甲基黄嘌呤均系SIGMA公司产品。牛血清白蛋白购自Roche公司。试验所需无机试剂购自广州市医药公司化试批发部,均系分析纯试剂。培养瓶购自KORNING公司。

1.2.2??培养基及主要试剂的配制??培养基A[1]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)培养基A制成细胞悬液,接种至25cm2培养瓶内,密度为每平方厘米3?10个细胞,置37#,体积分数5%CO2培养箱内孵育16h后,PBS轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质,换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化,3d后更换为培养基B,以后每2~3d更换一次培养基B。1.3.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的组织学染色??盖玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接种时置入培养瓶内,待细胞贴壁后每2、3d从培养瓶内取出染色。将贴有脂肪细胞的面朝上,浸入体积分

数为10%甲醛的等渗盐缓冲液中固定10min,然后放入PBS缓冲液中,轻轻漂洗片刻,直立使残留水份流到边缘,吸水纸吸掉。稍干燥后,人前脂肪细胞采用苏丹%??滴染法及Mayer苏木素复染细胞核,甘油明胶封片;皮肤成纤维细胞采用常规苏木素-伊红染色,脱水透明后中性树脂封片,光镜观察并拍照保留结果。

1.3.3??细胞生长曲线的绘制??将细胞悬液等量接种至24个培养瓶内,随机分成8组,每组3瓶,每2d检测一组中每个瓶中的细胞总数,取3个瓶的均值,如此至第8组结束。细胞计数方法参照医学细胞生物学实验[3]。

1.3.4??油红O染色提取法测定细胞内的脂肪含量??接种方法同1.3.3,根据Ramirez[2]4:按说明取DMEM/F??12培养粉5g,加入胎牛血清使其体积分数为10%,三蒸水定容至500mL;培养基B:按说明取DMEM/F??12培养粉10g,加入终浓度分别为15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸盐,17??mol/L人转铁蛋白,100000U/L青霉素,0??1g/L链霉素,100nmol/L氢化可的松,60nmol/L胰岛素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培养基C:取培养基A200mL,加入3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,使其终浓度为0??25mmol/L;消化液:称取胶原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至100mL;红细胞溶解缓冲液:称取适量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其终浓度分别为154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水

定容至250mL。上述溶液均经调整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔滤膜正压过滤除菌,分装后置-30#保存。油红O工作液[2]等的方法测定。培养物用体积分数10%甲醛的等渗盐缓冲液固定1h后,蒸馏水漂洗。吸取油红O工作液10mL,使培养面向下浸染,2h后倒掉瓶内的油红O

工作液,蒸馏水漂洗培养瓶数次,直至完全漂浮干净。将已染色的培养瓶置于32#孵箱内蒸发掉瓶内的水份后即加入1mL异丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,于HITACHIG2000型分光光度计510nm波长处测吸光度。:称取4??2g油红O溶于1200mL异丙醇中室温静置过夜,分析滤纸过滤后收集滤液,并加入900mL三蒸水,于4#再次静置过夜后过滤两次即可于室温贮存备用。1.2.3??仪??器??CO2培养箱,倒置显微镜等。1.3??方??法

1.3.1??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的原代培养[1]??术中切取脂肪组织约60g,同时切取皮肤组织约0??5cm?3cm进行成纤维细胞培养作为对照。PBS洗涤,分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管,皮肤组织则需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成约2mm?2mm的小块,加入消化液,置37#,体积分数5%CO2培养箱内消化。15h后,200?g短时离心,去除漂浮的脂肪细胞及培养液,沉积的细胞用红细胞溶解缓冲液再次配成细胞悬液,37#孵育10min,以去除污染的红细胞,150??2??结??果2.1??原代培养的人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞形态学观察细胞贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大(图1??1),4d即可观察到细胞渐成梭型,7d左右此棱形细胞大量繁殖,面积达到培养瓶底1/2之后开始积聚脂肪颗粒(图1??2)。9d可观察到细胞由棱形渐变成椭圆形或圆形(图1??3),积聚有脂肪颗粒的

第6期??王竹晨,等.人前脂肪细胞的原代培养445肪细胞(图1??4)。体外培养的脂肪细胞体积较大,细胞膜较薄,膜轮廓不光滑,凹凸不平有皱折,胞质内有大量圆形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量触合成大脂滴的情况,核仍位于边缘,而同时培养的皮肤成纤维细胞增殖速率相似,但始终为长棱形,无脂滴积聚(图2??1,图2??2)。

2.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的生长曲线

由生长曲线可见人前脂肪细胞(图3??1)和皮肤成纤维细胞(图3??2)的倍增时间分别为60h和55h

。3??讨??论3.1??人前脂肪细胞培养在妇科内分泌领域的研究意义脂肪细胞是脂肪组织的重要组成部份,也是其发挥功能的主体。当代研究认为脂肪组织中脂肪细胞非常活跃,细胞的数目,形态及细胞内脂肪的含量均处于动态变化之中,并保持终生。肥胖症被认为是脂肪细胞增殖和分化失控的结果。目前,肥

胖已成为与妇科内分泌领域密切相关的疾病,肥胖可产生胰岛素抵抗/高胰岛素血症,而胰岛素抵抗/高胰岛素血症是许多临床疾病或病症,尤其是常见的内分泌代谢性疾病如糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险信号,因此成为近年医学多学科共同感兴趣的研究热点。特别是近年的研究发现

图3.1??人前脂肪细胞生长曲线

Fig.3.1??Growthcurveforhumanpreadipocytesin

culture胰岛素抵抗/高胰岛素血症还与育龄妇女高雄激素血症及无排卵有关。临床常见的多囊卵巢综合症,

生育年龄妇女中约有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前认为多囊卵巢综合症即是以胰岛素抵抗为特征的内分泌代谢性疾患,继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用,并致不孕[4]。脂肪细胞作为对胰岛素

图3.2??人皮肤成纤维细胞生长曲线

Fig.3.2??Growthcurveforhumanskinfibroblastsinculture敏感的靶细胞之一,因此对其潜在胰岛素抵抗机制的研究具有特殊临床意义。体外前脂肪细胞培养

能完整地认识脂肪组织的发生和增生的全过程,并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控,研究其机制,是研究脂肪组织的理想模型。国外虽已建立了来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前为止,尚未见有人的前脂肪细胞株建立[5],因而使进一步的研究受到了限制。

3.2??体外培养的人前脂肪细胞的生物学特性

目前国内外前脂肪细胞体外培养系统大致有两类,一类来源于血管基质组份细胞(stromalvas??cularfraction,SVF),这是经典的前脂肪细胞。Van等[6]对SVF的系统研究形成了完整的前脂肪细胞理论。他们将切下的脂肪组织用胶原酶处理,再将组织悬液离心,其中的沉淀物基质血管成份即是SVF,将其SVF进行培养,和培养的成纤维细胞比较,这两种培养物以差不多的速率增殖,倍增时间约55h左右。在显微镜下比较细胞,发现起初2.3??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化前脂肪细胞内的脂肪含量于培养9d后迅速增加,16d左右到达高峰,而皮肤成纤维细胞内仅有极少的脂肪积聚(图4)

。图4??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化Fig.4??Thechangeofintracytoplasmiclipidsofpreadipocytesandskinfibroblastsinculture

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可积聚大量脂滴,而成纤维细胞的胞浆内则无或只有少量的脂滴。这就证明了SVF是具有增殖和向脂肪细胞分化潜能的前脂肪细胞。本实验研究结果与之相符,符合文献中提出的3个标准[6]。此外,近年还有人报道采用脂肪组织块贴壁和天花板培养相结合的方法也获得了成功[7]。此种方法得到的前脂肪细胞与SVF不同,可能来源于Carraro等发现的成熟脂肪细胞内都有的一种细胞岛[8]。但此种方法是采用有血清培养并且与成熟脂肪细胞共同孵育,不适于作为成熟脂肪细胞所分泌的某些细胞因子的体外研究模型。

前脂肪细胞的培养阐明了其增殖和分化的关系,目前认为这是一种生长停顿?生长再续?细胞分化的连续关系。生长停顿是必要的第一步,此后这些细胞至少进行一次以上的再分裂,才继续向成熟脂肪细胞转化。并随时间的推移出现甘油??3??磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物,这也是脂肪合成所必需的限速酶,并最终变成脂肪细胞。我们的研究也观察到细胞贴壁后经过一段时间的潜伏期后开始生长,3、5d左右大量增殖,1周后开始有脂肪颗粒的积聚。培养2周时,分化成多脂滴或单脂滴的脂肪细胞,与文献报道一致。

油红O染色提取法可简便、快速地对体外培养的前脂肪细胞转化率进行定量。文献报道其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似[2]。因此常用来作为对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定。体外培养的前脂肪细胞在胰岛素、氢化可的松等的作用下,GPDH即开始上升并迅速增加,8d左右达到高峰并维持在高水平[2]。我们采用油红O染色提取法进行研究,结果表明,前脂肪细胞在培养第3天即开始有脂肪的积聚,1周后积聚量明显增多,2周时达到高峰,与形态学上的培养1周后细胞内开始出现脂肪颗粒相吻合。并说明酶的出现在先,脂肪出现在后,细胞内脂肪含量的明显增加比GPDH的出现要晚1周左右,与文献报道相吻合[2]。

3.3??人前脂肪细胞培养技术的特点

脂肪组织来源于原始的网状结缔组织,由结缔组织和脂肪细胞组成,细胞成分中以脂肪细胞为主,此外还含有网状细胞,间充质细胞,组织细胞,内皮细胞等。脂肪细胞和成纤维细胞均来自中胚层,因此培养脂肪细胞和培养成纤维细胞具有相似[9]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)外培养条件有差异[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的这类物质有:胰岛素、糖皮质激素、甲状腺素、生长激素、转铁蛋白,3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,纤维粘连素等。培养基一般采用DMEM和F12按1!1比例配制,细胞数量适中,初次接种时细胞贴壁不十分牢固,动作要轻柔以免细胞漂浮。选用的取材对象越年轻越容易生长。人类一般选用外科手术切取腹部脂肪组织,如用注射器抽吸则易损伤细胞,降低成活率。(本文图1,2见插页2)参考文献:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.Effectsoftumornecrosisfactoralpha(TNF??)onglucosetransportandlipidmetabolismofnewly??differentiatedhumanfatcellincellculure[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.Quantitationofadiposeconversionandtriglyc??eridesbystainingintracytoplasmiclipidswithoilredO[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]赵??刚,刘建中.医学细胞生物学实验与习题[M].北京:科学出版社,1999.35.[4]DunaifA.Insulinactioninthepolycysticovarysyn??drome[J].EndocrinolMetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta??tusoffreefatgraftautotransplantationinplasticandre??constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.Cytologicalandenzymologicalcharacterizationofadulthumanadipocyteprecursorsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱晓海,何清濂,林子豪.人前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立[J].中华整型烧伤外科杂志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.Isletsofpreadipocyteshighlycommittedtodifferentiationincultureofadherentratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]刘??清,邓漪平.内皮-平滑肌联合培养:细胞间相互作用对组织型纤溶酶原激活剂的影响[J].中山医科大学学报,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,苏爱云,等.人表皮细胞的体外培养[J].中山医科大学学报,1998,19增刊:34.(??,)

脂肪细胞核怎么净化？

、最有效的减肥药:我平时主张的是，能运动减肥，就不要减肥药，当然一些无法坚持的MM是可以选择这种方式的减肥方法。

2、起床后先喝一杯蜂蜜水，早餐不可忽视。可以只吃一根香蕉，因为它含8卡路里的热量即可填饱肚子，但是空腹吃香蕉不是很好，所以建议喝一杯奶外加一个鸡蛋。 中餐1碗米饭（1-2两左右）+蔬菜纯慧+少许的肉，以牛肉为佳哦。但以6-8分饱为宜。 晚餐吃减肥餐，喝一盒脱脂的牛奶或是一个鸡蛋或是一个苹果或是黄瓜代替晚餐。

以上三餐，中晚餐禁吃甜食，要预先控制好每餐食物的份量，以免多吃。要多吃纤维质食物，比较不容易饿，容易维持三餐的定时、定量。还有，一定不要吃油炸、油腻、过甜、过咸的食物，因为这些是减肥的天敌哦！不要暴饮暴食，饭后泡一杯旨日清纤秀减肥茶，可以减少脂肪的吸入。

3、一定要多喝水，每天至少6大杯。开水可帮助你减少饥饿感，冲掉体内的多余脂肪，保持新陈代谢的畅通。

4、一周量一次体重，不要多量，如此才能看到真正的进步。 若你已节食很久，就应注意自己的健康状况，要确定自己吃下的食物都很均衡，维他命摄取量也足够，千万别病倒了。

5、每天要适当的做些运动以配合饮食，适度的运动会减低食欲，增加脂肪燃烧的速度。 运动呢可以选择快走、慢跑、跳绳等方式，也可以转呼拉圈哦！如果在家或是办公室没有条件跳绳的话，可以选择原地双脚跳，一般这样的运动时间在30分钟左右，但也要因人而异，一定要采取循序渐近的方式，不要太急于求成。记着，跑完后要做一下伸展运动，或是找一个及胸高的地方压压腿，方法呢就是脚尖使劲的往脸部靠，同时还要拍打小腿，这样做的目的是把小腿的肌肉高简拉伸，放松，不会成块状，而是条状，看起来会很瘦的哦！完了后再侧身，两手抱在头上，压一压腰。

6、提供一些我经常吃的减肥食物：全麦面包，玉米，米饭（一定要少，一顿1-2两）、鸡蛋，做念答鸭蛋、豆浆，牛奶（要脱脂的），苹果，黄瓜，苦瓜，海带，芹菜，黑木耳，西红柿，冬瓜，豆腐，豆皮，韭菜，紫菜头，鱼、虾、鸡肉（要吃鸡胸脯肉），一切的蔬菜。