外泌体蛋白质组与dia蛋白质组（外泌体和细胞外基质）

本文目录一览：

• 1、关于TMT/iTRAQ和DIA技术的选择？
• 2、dia是什么的缩写
• 3、细胞外泌体是什么？
• 4、重磅！非因指南性综述引领液体活检蛋白组技术新风尚!

关于TMT/iTRAQ和DIA技术的选择？

我们知道，TMT/iTRAQ子离子标记定量和DIA非标定量是目前蛋白质组最常用的两项技术。一般而言，小样本量，如10样本以上的项目推荐采用TMT/iTRAQ；大样本量的项目推荐采用DIA。为什么呢？

DIA技术因为全采模式被吹上了天，其实应用并没有传说中那么广，只能说是趋势。DIA绝非万能，技术的选择要视情况而定。

首先要明白DIA的优势是在稳定性和覆盖度上。小样本量的实验，比如9个样：对照组、处理组1、处理组2，每组3个生物学重复，DIA的稳定性没有发挥空间。DIA则通常不做分级（成本、数据处理等因素考量），例如对于常规动物组织样本，一般大约定量到6000个蛋白左右，覆盖度的优势也没体现出来。而TMT可通过大量的分级（fractionation），显著提升定量蛋白的数量，同样的常规动物组织样本，TMT通过大量的分级，可定量多至8000+个蛋白的水平。

此外，DIA的实验流程比较复杂，需先建一个图谱library。在样本数量少的情况下，先花机时完成libirary构建，再花机时进行样本的DIA检测。反而不如一次性做TMT来得经济、快捷。

假如你有30个样本，用TMT-11plex，1个plex最多混11个样本，至少也得做3个plex。而且，通常为了提高数据量，每个plex还会做大量的分级，最终会有非常多的上机。关键在于，在这种情况下，多个批次的plex是分别上机检测的，这就会在实验的平行性、稳定性上造成问题。甚至可能做出多批plex的数据，由实验本身导致的各批plex之间的差异性，能完全掩盖实验组别之间的差异。所橡弊腔以，在大量样本上机的情况下，DIA的稳定性优势尽显无疑。

绝大多数采用常规蛋白质组技术的血液研究，都是先利用亲和等方法将血液中高丰度蛋白（白蛋白、IgG等）去除掉，再做蛋白组分析。因为常规蛋白质组受到高丰度信号的影响非常严重。如果不预先去除高丰度蛋白，获得的结果中大量的数据都是大家所不关注的高丰度蛋白的数据，有意义的数据非常少。

而DIA的全扫描模式，受高丰度蛋白影响很小，目前DIA发表的血液蛋白质组研究均不去除高丰度蛋白，不仅获得的数据量不亚于常规蛋白质组的做法，并且其好处是：（1）不用担心高丰度蛋白去除时带走了其他蛋白，造成结果失真；（2）不用担心高丰度蛋白去除操作，引入的平行性隐患；（3）不用担心去除高丰度蛋白实验涉及的实验成本、时间等问题。第二、三点在大规模样本的分析中是重要的考量因素。

为什么要建library？ 质谱对蛋白质肽段的鉴定，基于一级信号及其二级图谱，在常规蛋白质组的扫描模式下，1张二级图谱几乎仅来自于1个一级信号；而在DIA的扫描模式下，1张二级图谱是一个混合图谱，来自于多个的一级信号，其高度复杂。导致常规蛋白质组搜索理论图谱就行了；而DIA的太复卜中杂，要搜实际质谱采集到的图谱，即library（也有不构建library的做法，但准确性、匹配效率效果影响较大）。

library是不是越大越好？ 将谱图库扩容，是不是做大量的分级就行了。实际情况是，通过分级将library的库容提升到一定程度时，其对提高最终的鉴定数量不会再有显著贡献。所以不建议盲目地做大量的分级。要真梁衫正提高library的库容，除了分级，比较重要的就是样本的积累：即不断有不同实验来源、不同生物学背景的新样本的library加入。在这点上，越早开展DIA分析、样本和项目数量积累越多的平台，越有优势。

library匹配算法选择？ 解析DIA的复杂数据是关键。Spectronaut/skyline/openSWATH.......

色谱考察和校正 。色谱的峰形、色谱的数据数量点、色谱的稳定性，都直接决定定量准不准；另外，色谱的capacity能力，决定质谱的采集效率。在此基础上，在DIA的大量样本的分离采集过程中，色谱的效果不可避免会波动和下降。所以，不仅要考察色谱的效果，还需要对色谱进行校正（例如掺入iRT内标肽）。

搜库匹配可信度评价 。不同软件给出的判别指标不同。

QC样本评价 。QC样本是用于整体评价数据的最有效方法。QC样本通常是将多个实验样本进行混合，再分为同样的多份。上样时隔一定数量的样本，掺入1份QC样本。因此，最终整个上机过程中会有多个相同的QC样本贯穿其中。假设整个采集过程是稳定的、平行的，那QC样本的数据也应基本一致。最终，我们利用定量偏差（CV值）、主成分分析、相关性等方法，对QC样本的一致性进行评价，以反映整个数据采集过程中的稳定与平行。

dia是什么的缩写

dia是什么的缩写：data independent acquisition.

Q1. DIA技术和PRM技术可否共用数据库？

回复：理论上如果是同一个样本、共用同一个库的话是可以的，但前提是实验要在同一台质谱仪上进行，且时间间隔较短。

Q2. 如果样品中有高丰度蛋白是否需要去除？

回复：碰到有高丰度蛋白的样烂大品，需要饥首竖去除高丰度蛋白，费用也单独收取。

Q3. DIA技术适用什么样的样品？

回复：所有的样品都可以做，只要蛋白的量满足要求。

DIA原理：

液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）相结合的技术成为蛋白质组研究的主要研究手段。在自下而上的蛋白质组学中，蛋白质通过蛋白水解酶消化成肽段，这些肽段通过高效液相分离后经电喷雾电离源（ESI）加上电荷，发射到质谱仪中进行一级质谱（MS）和二级质谱（MS/MS）的分析。

一级质谱由肽段离子的质荷比和信号强度组成，二级质谱由肽段碎裂后的碎片离子质荷比和信号强度组成。

DDA为数据依赖性采集方式，选择一级质谱中特定数量的肽段分子（如信号强度最强的前10个离子）进行高能碰撞碎裂，产生的碎片离子送入二级质谱检测。

DIA为数据非依赖性采集方式，随着时间连续设置一定范围的质荷比窗口，对将通过窗口的全部肽段离子进行碎裂并用二级质谱检测碎片离子的信号。相比之下，DIA模式不涉及到对肽段离子的限制性筛选，定量准确性和重复性都要优于DDA模式。

但DIA模式产生的碎片离子谱图过于复杂，丢失了肽段及碎片离子的对应关系，对芹谈其结果的解析较为困难。目前的方法是通过建立样本的参考库（如同一样本的DDA数据），对DIA的混合数据进行去卷积分析来鉴定和定量肽段。

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研乎衫没究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎塌吵牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验岁纳时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

重磅！非因指南性综述引领液体活检蛋白组技术新风尚!

2022年2月15日，非因生物以第一作者和通讯单位、联合美国纽约圣约翰大学陈哲生教授等在《Molecular Cancer》杂志上（ IF：27.401 ）发表了题为“Proteomics technologies for cancer liquid biopsies”的综述性文章，回顾了包括RPPA在内的多种高通量蛋白质组学技术在肿瘤液体活检中的研究进展及临床转化应用策略。

本文简要介绍了能够从液体活检样本中同时检测至少数百种蛋白质的高内涵蛋白质组学技术原理（图1），包括：RPPA反相蛋白微阵列技术（非因生物提供）、质谱技术、抗原/抗体阵列技术、基于核酸适配体（Aptamer）的检测技术和邻位延伸技术（PEA），并比较了上述各技术的优劣势（表1，嫌长不看也要看的表），同时介绍了各技术在癌症液体活检研究领域和临床转化方向的应用进展。（ 原文链接： ）

蛋白组学液态活检生物标志物研究背景

与肿瘤诊断的“金标准”组织活检相比，液体活检可通过最小入侵方式获得检测样本，同时克服异质性，实现动态监测。目前用于液体活检的体液主要为血液和尿液，但理论上，液体活检适用于任何人体内循环或其他人体相关的液体（图2）。作为大多数细胞功能的直接执行者和当前大多数癌症治疗中的直接药物靶标，多重蛋白质组学数据的分析，可能会在癌症进展的所有阶段实时提供更加宝贵的临床相关信息。液体活检样本中的蛋白质组具有巨大复杂性，如蛋白质丰度和翻译后修饰持续且快速的变化，同时蛋白质组技术与高度复杂的测序技术相比仍存在一定局限性，导致蛋白质组学的探究仍然落后于基因组技术，且目前临床转化效率极低，仅通过40多个基于液体活检的蛋白组生物标志物。因此，迫切需要新的蛋白质技术来实现在癌症液体活检中发现生物标志物的目标。

各技术比对

一、 质谱技术（MS）

由于体液样本中蛋白的复杂性，现代质谱技术通过不断优化样本制备方法、开发蛋白定量技术以及改变质谱扫描模式来提高检测精度。质谱法无需假设驱动，可以无偏倚地对样本中的蛋白进行扫描，因此可作为癌症体液样本早期生物标志物发掘的首选方法。目前基于质谱的生物标志物策略主要有：（1）在发现、核实、验证三个阶段，样本数量递增，而检测蛋白范围逐渐缩小的 “三角策略” ；（2）在发现和验证阶段均用“鸟枪法”在大样本队列检测尽可能多的蛋白，平行分析显示共同显著差异的蛋白可作为准生物标志物的 “矩形策略” 。目前基于质谱的液体活检已应用于卵巢癌、泌尿系统癌症、结直肠癌等多种癌症。但如想将质谱应用于广泛的临床试验，还需简化和标准化检测流程、提高检测的通量、精度和鲁棒性，并突破对翻译后修饰蛋白的检测局限性。

二、抗原/抗体阵列技术

抗体阵列 是将特异性抗体固定到带有修饰的平面基质上，通过荧光、化学发光或寡核苷酸标记的方式对样本进行多重靶标（通常为几百种）检测的方式。适用于血清学分析，如肿瘤相关的低丰度分泌蛋白的检测。但受到检测通量、检测动态范围、以及批次效应和信号饱和度、定量精确度的限制，抗体阵列仅可作为基于体液的蛋白组学分析的方法学之一。 抗原阵列 又称功兄槐帆能蛋白阵列，可作为抗原检测平台来检测抗体组成的细微变化，其早羡雹期热点应用是通过血清自身抗体（AAB）来进行生物标志物的研究。最全面的人类抗原阵列覆盖超过81%的蛋白，是血液蛋白全景分析的强有力的工具。但抗原阵列的靶点扩展、可重复性、批次效应和高昂的成本，仍使抗原阵列的应用有所局限。

三、 基于适体的检测

SOMAscan是目前高通量蛋白组检明信测的“新贵”工具，基于能够与不同蛋白质进行紧密结合的慢速率修饰的蛋白质适体（SOMAmer）进行检测。SOMAmer是寡核苷酸配体，结合上可光解的接头或荧光标签，通过构象识别与待测靶标结合，经生物素介导的纯化后，紫外光照射洗脱SOMAmers，并对其进行表征和定量已反应待测样本内的蛋白丰度。该方法具有超高特异性和亲和力，以及较低的批次间差异，目前可平行分析7000+种蛋白质，在结直肠癌和非小细胞肺癌的临床相关的生物标志物筛选中起到关键作用。但与抗体检测相比，现阶段可供研究使用的适体种类有限，尤其是翻译后修饰蛋白为导向的适体开发仍处于初期阶段。同时由于适配体对抗原决定簇的超高亲和力，在蛋白标志物研究的进程中会受到大量信号干扰，影响检测准确度。

四、邻位延伸技术（PEA）

PEA结合了基于抗体的免疫分析（ELISA）和PCR或二代测序（NGS）技术，与质谱检测相比，实现了用更低的样本量检测更广泛的动态范围，高灵敏、高准确、可重复且高保真识别。最先进的PEA检测目前由Olink商业化，可对3072个靶标进行标准测量。PEA首次应用于结直肠癌血液预后标志物的鉴定，后续应用于卵巢癌、前列腺癌等癌种的早期检测、伴随诊断和疾病监测。PEA检测与读取方式（qPCR、NGS）相关，当进行大队列样本分析时，仍需考虑实验误差和批次效应，其次翻译后修饰蛋白的研究对于抗体对开发具有很大瓶颈，对其捕获受到一定限制。

五、反相蛋白微阵列技术（RPPA）

RPPA起源于20年前，是将完全变性的蛋白裂解液固定在特殊载玻片上，通常每种裂解液会进行浓度梯度稀释，接下来用验证好的高度特异性的抗体孵育点样后的载玻片，通过信号放大化学显色或荧光检测捕获定量信息（图3）。RPPA可广泛应用于几百到超过一千个大样本的超稳健平行分析，定量精准，可对500+种细胞表面受体蛋白、细胞信号关键蛋白及蛋白修饰（磷酸化、乙酰化、甲基化等）、蛋白酶类、转录因子等各类代表性靶标进行分门别类的系统深度检测，包括直接和间接的上下游蛋白网络分析。基于以上特征，RPPA广泛应用于癌症基因组图谱项目（TCGA），其公共数据集可在线获取（TCPA，）。RPPA由于其最小的批次差异，可以作为蛋白质生物标志物验证的强大工具，并已成功应用于肺癌的新型生物标志物验证。另外，对外泌体蛋白的检测也成为RPPA在癌症液体活检中的另一项热点应用。 非因生物在国内搭建了基于MD安德森金标准的RPPA分析技术平台，先期完成了一系列工作流程的开发、验证及优化，不断扩展抗体库，并且建立了完备的生信分析体系。帮助国内科研，临床及工作者及广大药物研发相关用户快速高效开展疾病，尤其是肿瘤相关信号通路全景分析、分子机理挖掘、肿瘤相关药理学研究及靶向药物开发。RPPA复杂的技术流程和严格的抗体筛选过程将不再成为国内科研工作者的开展基础和转化医学研究的绊脚石。（点击下方“ 阅读原文 ”，了解详情）

展望

未来，在蛋白质组学技术不断发展的前提下，各技术之间的联合互补应用可以作为可行的、基于肿瘤体液活检的生物标志物正交验证策略(如图4所示)。非因生物依托RPPA技术等各项新型组学技术，将肿瘤精准治疗研究和转化作为核心使命，我们期待着一个更加精简但连贯且标准的蛋白类生物标志物开发流程的出现，并最终应用于癌症转化医学研究。