外泌体circRNA生信分析（外泌体 生信）

本文目录一览：

• 1、纯生信分析套路 综述|癌症中m6A与非编码RNA之间相互作用新见解
• 2、circRNA研究应用专篇①：“sponge”与“biomarker”
• 3、非编码RNA生信分析
• 4、circRNA研究知多少

纯生信分析套路 综述|癌症中m6A与非编码RNA之间相互作用新见解

说起国自然研究新宠儿 “m6A甲基化修饰” ，想必大家都不陌生，m6A甲基化是包括mRNA和ncRNA（即非编码RNA，包括miRNA，rRNA，circRNA和lncRNA等）在内的所有RNA最普遍的表观遗传修饰。越来越多的证据表明，m6A甲基化修饰在各种生理和病理过程中都起着至关重要的作用。今天就向大家分享一篇发表在Molecular Cancer（IF：15.302）杂志上的关于m6A与ncRNA在癌症中相互作用的综述文章。

Part 1.初识m6A甲基化真面目

m6A，又称N6-甲基腺苷，指腺嘌呤的第6位氮原子（N）发生了甲基化修饰，通过甲基化酶复合物对甲基进行“书写”(Writer)、“擦除”(Eraser)或“阅读”(Reader)，进而对RNA发挥调控作用。

m6A甲基化的分子组成 —甲基化酶复合物

1)  甲基化转移酶(methyltransferase)：被称为“编码器”(Writer)，主要包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、METL16、RBM15 / 15B等；

2) 去甲基化酶(demethylase)：被称为“消码器”(Eraser)，主要包括FTO、ALKBH5等；

3)  m6A识别因子(recognition factors): 被称为“读码器”(Reader)，主要包括YTHDC1/2、YTHDF1/2/3、HNRNP、eIF3、IGF2BP1 / 2/3等。

图1.m6A甲基化修饰示意图：m6A甲基化是一个动态可逆的过程，由“Writer”、“Eraser”、“Reader”三者共同完成。

Part 2.m6A甲基化修饰miRNA

miRNA的失调参与多种生物学行为，如小鼠胎儿发育，免疫应答，炎症反应和致癌等，研究表明，m6A甲基化可以修饰参与多种miRNA的成熟，参与该过程的主要是甲基化转移酶METTL3和METTL14等：

① METTL3促进miR-25-3p成熟，miR-25-3p在胰腺导管腺癌（PDAC）中起关键作用；

② METTL3增强pri-miR-221 / 222与DGCR8的结合，而DGCR8参与了膀胱癌的增殖；

③ METTL3促进pri-miR-1246的成熟从而促进结直肠癌（CRC）的转移；

④ METTL3加速miR-143-3p的成熟，导致METTL3 / miR-143-3p /仔乎 vasohibin-1轴的形成，有利于肺癌的转移；

⑤ METTL3通过修饰多个miRNA（miR-106b，miR-18a / b，miR-3607，miR-423，miR-30a，miR-320b/d /e）影响砷诱导的癌变；

⑥ METTL14促进pri-miR-126的成熟，从而可以抑雀皮制肝癌（HCC）的侵袭和转移。

图2. m6A甲基化修饰miRNA：调节胰腺导管腺癌，肺癌，肝癌，膀胱癌和结直肠癌等癌症的发生和转移

Part 3.m6A甲基化修饰lncRNA

lncRNA一般指长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，可在癌症中被m6A甲基化修饰，参与该过程的主要是甲基化转移酶METTL3、METTL14，去甲基化酶ALKBH5，m6A识别因子YTHDF1、IGF2BP2等：

① MALAT1是首个被发现与肺癌相关的lncRNA，METTL3可以调节MALAT1-miR-1914-3p-YAP轴来诱导非小细胞肺癌的耐药和转移，还可以通过MALAT1/miR-145/FAK途径加重梗阻念岁悉性肾病的肾纤维化；

② METTL3上调LINC00958，并使miR-3619-5p海绵化而促进HCC细胞的迁移和侵袭；

③ METTL3家族成员FAM225A充当海绵miR-590-3p / miR-1275的ceRNA和上调ITGB3来促进鼻咽癌（NPC）的发生和转移；

④ METTL3/14通过上调DKK1的lncRNA激活调节剂（LNCAROD）来增强头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的迁移；

⑤ METTL3介导lncRNA RP11通过Zeb1的上调增强CRC迁移和侵袭，而

METTL14增加lncRNA XIST的m6A水平，抑制CRC的增殖和转移；

⑥ ALKBH5通过维持FOXM1表达和细胞增殖程序来维持胶质母细胞瘤类干细胞（GSCs）的致瘤性，lncRNA FOXM1-AS可促进ALKBH5与FOXM1之间的相互作用；

⑦ ALKBH5通过减少lncRNA NEAT1的甲基化来促进胃癌（GC）的侵袭和转移。

⑧ YTHDF1与LINC00278相互作用可抑制食管鳞状细胞癌（ESCC）转移，而ALKBH5则促进ESCC转移；

⑨ IGF2BP2作为m6A读取器调节LncRNA DANCR，有利于胰腺癌的致癌性。

图3. m6A甲基化修饰lncRNA：参与多种癌症的肿瘤发生和转移，包括GSC，HNSCC，NPC，ESCC，肺癌，GC，HCC，胰腺癌和CRC

Part 4. m6A甲基化修饰circRNA

circRNA一般指环状RNA。环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子（在活体中有时也有表达），也是RNA领域最新的研究热点。

circRNA在蛋白质翻译中起着至关重要的作用： METTL3和YTHDC1与环状RNA锌指蛋白609（circ-ZNF609）的代谢有关，并促进其生成，circ-ZNF609促进蛋白翻译和成肌细胞增殖；核糖体-circRNAs的“迷你基因”可以促进果蝇头部的蛋白翻译；

m6A甲基化会影响cricRNAs的蛋白质翻译： m6A基序在circRNA中富集，单个m6A位点被认为是启动circRNA翻译的触发器。m6A调控因子METTL3/14、FTO、YTHDF3和起始因子eIF4G2参与了m6A驱动的蛋白翻译。哺乳动物细胞可以识别circRNAs上的m6A修饰，通过抑制免疫基因激活和佐剂活性来抑制先天免疫。

circRNA的失调与多种癌症进展相关： circNSUN2的m6A甲基化修饰可促进细胞质输出并稳定HMGA2，从而促进结直肠肝转移；circPVRL3的m6A甲基化修饰可促进胃癌细胞的增殖和迁移。

表1：m6A甲基化修饰癌症中的ncRNA

Part 5. ncRNA调节癌症中的m6A甲基化

非编码RNA（ncRNA）具有影响涉及多个生物学过程m6A水平的能力。

miRNA调节癌症中的m 6 A甲基化：

① miR-33a通过靶向METTL3 mRNA抑制NSCLC细胞的增殖；

② miR-600抑制METTL3的表达并逆转了METTL3对NSCLC进展的积极作用；

③ miRNA let-7g通过靶向3'UTR下调METTL3表达，加速乳腺癌细胞的增殖；

④ miR-1266通过直接靶向FTO促进CRC的发生和发展；

⑤ miR-145通过靶向YTHDF2来抑制HCC的增殖；

⑥ miR-488是一种通过靶向eIF3a发挥作用的抑癌miRNA，还参与NSCLC细胞中eIF3a介导的顺铂耐药性；

⑦ miR-141通过形成miR-141 / IGF2BP2 / P13K / Akt轴来抑制胰腺癌的增殖。

lncRNAs调节癌症中的m 6 A甲基 化 ：

① lncRNA LINC00470与METTL3相互作用促进PTEN mRNA降解，从而促进GC进程；

② lncRNA miR503HG通过调节肝细胞癌中的HNRNPA2B1 /NF-κB途径来抑制肿瘤转移；

③ lncRNA LINC01234与HNRNPA2B1相互作用，促进NSCLC中的细胞增殖并抑制细胞凋亡；

④ lncRNA LIN28B-AS1与IGF2BP1相互作用，促进肺腺癌（LUAD）的增殖和转移；

⑤ lncRNA LINRIS可稳定IGF2BP2并促进CRC增殖；

⑥ lncRNA GAS5-AS1与ALKBH5相互作用调节GAS5的表达抑制子宫颈癌（CC）细胞的增殖，迁移和侵袭；

⑦ lncRNA GAS5可以抑制YAP介导的YTHDF3，从而抑制CRC的增殖；

⑧ lncRNA GATA3-AS增强KIAA1429和GATA3 pre-mRNA之间的相互作用，促进肝癌的进展。

表2：ncRNA调节癌症中的m6A甲基化

Part 6. m6A甲基化在癌症中的临床应用

m6A甲基化是癌症诊断和预后的新生物标记

① METTL3，YTHDC2和HNRNPC用于预测HNSCC患者的预后；

② METTL3/FTO上调或YTHDF2和METTL14下调可能预示GC、CRC和HCC的生存率较差；

③ METTL14低表达与肿瘤分化、临床分期、微血管浸润有关；

④ ALKBH5或FTO下调预示肺癌和HCC预后不佳；

⑤ IGF2BP2被认为是胰腺癌，食管胃交界腺癌和CRC的预后标记物。

m6A甲基化参与耐药性和癌症治疗

① METTL3稳定YAP和ARHGAP5，诱导NSCLC和胃癌顺铂耐药；

② HNRNPA2B1在他莫昔芬耐药乳腺癌中过表达，降低他莫昔芬的敏感性；

③ METTL3、METTL14、FTO、YTHDF2在急性髓性白血病（AML）中过表达，FTO抑制剂（FB23）及其衍生物（FB23-2）通过靶向FTO促进AML中的髓样分化和凋亡；

④ m6A甲基化参与胃癌的肿瘤微环境和TME浸润特征评估；

⑤ YTHDF2与炎症浸润，血管重建和远处转移相关，并预示肝癌的不良预后。

生信人往期也有很多有关m6A的好文章可学习：

m6A+免疫浸润

m6A+突变思路

m6A调节因子泛癌分析

结语

越来越多的研究关注于m6A甲基化如何改变ncRNA的稳定性、剪接和翻译，或ncRNA如何在癌症中调控m6A。m6A甲基化与ncRNA的相互作用可影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等不同的生命活动。就m6A甲基化的临床应用而言，可作为癌症诊断、预后和治疗的潜在靶点。然而，m6A甲基化与ncRNA之间的特异性结合位点还需要进一步研究。

无论是对于正在为写标书申基金发愁的老师们，还是正在为毕业课题发愁的研究生们来说，相信这篇综述都能够帮助你更好的理解m6A甲基化与ncRNA之间的相互作用，为你的课题添光加彩，感兴趣的小伙伴们赶快阅读起来吧！

circRNA研究应用专篇①：“sponge”与“biomarker”

circRNAs（Circular RNAs，环状RNA分子）是一类不具有5'末端帽子和3'末端 poly(A) 尾巴、并以共价键形成闭合环形结构的非编码RNA分子，在真核生物中广泛存在。近年来，circRNA 基金情况呈现增长趋势，在2020年基金额达到3000万+（数据摘自：Let Pub），研究热度可见。

circleRNA 的研究为何如此火热？它们在生物体的生长发育过程中、生理生化反应中凭借其独特的结构发挥着怎样的作用？别急，circleRNA 研究应用之上篇——sponge+biomarker，我为您倾情奉上，祝您科研一臂之力！

1、miRNA 分子海绵（sponge）

circRNA 含有大量的 miRNA 结合位点，具有 miRNA 海绵作用，进而间接调控 miRNA 下游靶基因的表达。

2、生物标志物（biomarker）

circRNA结构稳定、半衰期长，可在组织和发育阶段特异性表达，circRNA不仅存在于组织和细胞中，而且在体液中也有大量存在，可作为生物标志物。

作用机制：miRNA 海绵

背景：化疗耐药是三阴性乳腺癌（TNBC）临床治疗失败和预后不良的主要原因。 circRNA 在TNBC 化疗耐药性方册尺面的研究尚为空白。

研究结论： CircWAC / miR-142 / WWP1形成竞争性内源RNA（ceRNA）网络，CircWAC通过靶向结合miR-142，上调WWP1并激活TNBC细胞中的PI3K / AKT信号传导活性进而诱导三阴性乳腺癌的化疗耐药性。

作用机制：miRNA 海绵

背景：CircRNA 的异常表达会导致人类疾病。circRNA 通过特定的 microRNA 来调节基因表达。本研究探讨 circMAP3K5（环状有丝分裂原激活的蛋白激酶5）是否可以充当竞争性结合内州橡高源性 microRNA-22-3p（miR-22-3p）海绵并调节新内膜增生。

研究思路：

研究结论：研究确定 circMAP3K5 为 TET2 介导的血管 SMC 分化的主要调控因子。靶向 circMAP3K5 / miR-22-3p / TET2 途径可能为与内膜增生相关的疾病（包括再动脉粥样硬化）提供潜在的治疗策略。

作用机制：biomarker

背景：目前，血液生物标记物已经被广泛用于癌症诊断，但低敏感性和特异性限制了它们在普通人群癌症筛查中的广泛应用。目前，研究者正致力于通过微创技术（即液体活检）获得新型、高精度的人体体液生物标志物。近年来，快速发展的高通量转录组分析技术已证实许多 circRNA 稳定存在于诸多体液中，包括血浆、血清、外泌体和尿液等。

研究思路：

研究结果：多种肿瘤研如备究结果证实，circRNA 可作为液体活检的重要分子标志物，作者还使用R中的 shinys 包开发了一个新的、直观的 web 界面，供用户探索和分析 circRNA。

作用机制：biomarker

研究背景：

胃癌是世界上最常见的癌症之一。由于缺乏特异性症状，80%以上的患者确诊时已是晚期，死亡率高，因此早期胃癌诊断势在必行。

研究思路

研究结论：

circPTPN22 可以作为一种有效的胃癌诊断和预后生物标志物，circPTPN22 表达下调，可通过影响EMT途径抑制胃癌细胞的增殖和转移，该研究成果提示，circPEPN22 可能通过 ceRNA 机制影响胃癌的进展。

参考文献：

1、 Wang L , Zhou Y , Jiang L , et al. CircWAC induces chemotherapeutic resistance in triple-negative breast cancer by targeting miR-142, upregulating WWP1 and activating the PI3K/AKT pathway[J]. Molecular Cancer, 2021, 20(1).

2、Zeng Z , Xia L , Fan S , et al. Circular RNA CircMAP3K5 Acts as a MicroRNA-22-3p Sponge to Promote Resolution of Intimal Hyperplasia via TET2-Mediated SMC Differentiation[J]. Circulation, 2021, 143(4).

3、Wang S , Zhang K , Tan S , et al. Circular RNAs in body fluids as cancer biomarkers: the new frontier of liquid biopsies[J]. Molecular Cancer, 2021, 20(1).

4、Ma S , Kong S , Gu X , et al. As a biomarker for gastric cancer, circPTPN22 regulates the progression of gastric cancer through the EMT pathway[J]. Cancer Cell International, 2021, 21(1).

非编码RNA生信分析

发在Journal of Translational Medicine（4分）。

原文： Circular RNA regulatory network reveals cell–cell crosstalk in acute myeloid leukemia extramedullary infiltration

解读： 生信SCI如何入门火爆的环状RNA领域

1、环状RNA的差异分析火山闭岩图和聚类图。根据差异分析，再加入正常人的对比信息（见韦恩图旁边的标注），找到了82个上调以及27个下调的环状RNA分子，并绘制了热图（为什么需要正常人信息？为什么不是直接的两种AML的对比）。

“假基因”的研究，发在 Epigenomics （5分）。

假基因，也称伪基因，是基因进化过程中的不具有编码功能的残留物。它是最早在研究非洲爪蟾过程中发现的。它与正常基因非常相似，但不具有正常基因的功能。近年来研究发现，假基因的异常调节会导致多种疾病的发生和进展，这其中就包括了恶性肿瘤。假基因转录形成的RNA也是非编码RNA（miRNA, lncRNA, circRNA）中的一种。

原文： Integrated analysis of pseudogene RP11-564D11.3 expression and its potential roles in hepatocellular carcinoma

解读： 基因还有“假”的！然后5分的SCI就这么到手啦

这里不再赘述行态氏了，直接读读上述解读链接的内容吧。

其中，比较套路的是：

1、作者如何筛选到那个要研究的假基因RP11-564D11.3：3种癌症中差异分析初筛、多种癌症验证筛选、生存分析筛选，然后就只剩一个共同的了。

2、 假基因-miRNA-mRNA调控网络 的构建，这是非编码RNA的基本套路，Cytoscape分析。

3、 功能富集分析 ：此处不是常规的分析方法，用到了Cytoscape的插件 ClueGo 。但我更关心的是，这里的富集分析是基于什么？直接用假基因RP11-564D11.3？还是用上述网络得到的潜在靶向基因？档散还是用上述建立的网络？不太明白，文中也没详述。个人对富集分析的理解还是要有一堆基因才能做。

4、 PPI分析 ：根据node degree筛选其中的hub基因（STRING和Cytoscape分析）。之后可以从hub基因中筛选与预后相关的基因。

5、如何得到假基因下游的关键靶点基因VEGFA：先选定最有可能分析出结果的癌种，然后再这个癌种里进行基因的预后分析，只有VEGFA提示预后不良且具有统计学意义。

文章的结论是：VEGFA是假基因RP11-564D11.3下游的一个靶点。

circRNA研究知多少

circRNAs（Circular RNAs，环状RNA分子）是一类不具有5'末端帽子和3'末端 poly(A) 尾巴、并以共价键形成闭合环形结构的非编码 RNA 分子，在真核生物中广泛存在。circRNA 的功能研究主要集中在发育、组织特异性和疾病研究三个方面，在糖尿病、神经系 统疾病、心血管疾病和癌症等疾病中具有重要的研究价值，是多种疾病的功能生物标志物和治疗靶点，已迅速崛起成为新兴生命科学与医学的研究热差卜点。 

1、miRNA 分子海绵

circRNA 含有大量的 miRNA 结合位点，具有 miRNA 海绵作用，进而间接调控 miRNA 下游靶基因的表达。

2、调控基因转录

circRNA 也可以通过与 RNA 结合蛋白的结合来调控蛋白功能，比如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录。

3、编码潜能

circRNA 虽然属于非编码 RNA，但是也有少数 circRNA 可以编码多肽，通过该多肽行使调控功能。

案例一  circRNA充当miRNA海绵或与RNA结合蛋白结合发挥功能

环状RNA FOXP1通过调节  PKLR 的表达来促进胆囊癌的肿瘤进展和Warburg效应[1]

研究通过对GBC及 邻 近 正 常 组 织 的 RNA 进 行 序 列 分 析，发 现 在 GBC 组 织 中， circFOXP1(hsa-circ-0008234)的表达显著上调，与淋巴结转移、TNM 分期进展及预后不良呈正相关。短发夹 RNA 介导的  circFOXP1  基因敲除或外源性表达结合体外实验表明，circFOXP1具有促进 GBC 细胞增殖、迁移、侵袭和抑制细胞凋亡等多种作用。在体内，circFOXP1 促进肿瘤生长。机制上，双荧光素酶报告、RNA 免疫沉淀(RIP)和生物素标记的 RNA pull down 证实，circFOXP1 与 PTBP1 相互作用，PTBP1 可结合肝红细胞丙酮酸激酶(PKLR)的 3'UTR 区和编码区(CDS)，察庆腊以保护 PKLR mRNA 不受衰变。此外， circFOXP1 作为 miR-370 的海绵调节 PKLR，从而促进 GBC 进展中的 Warburg 效应。这些结果表明，circFOXP1 是 GBC 进展和 Warburg 效应的预后生物标志物和关键调节因子，预示了GBC治疗的潜在靶点。

案例二 circRNA可翻译

去极化相关的circRNA调节神经基因表达的同时在某些情况下可能作为翻译模板[2]

环状RNA(circRNA)是哺乳动物大脑中一类相对新的，具有高丰度的 RNA 转录本。该研究发现在分化型神经母细胞瘤中表达的 circRNA 在细胞去极化后明显改变，其中 107 个上调，47 个下调；该现象与去极化细胞中的 mRNA(n = 1511)和 miRNA(miRNA) 表达的整体改变相吻合(n = 269)，表明 circRNA-miRNA-mRNA 的调控轴参与细胞对神经活动的反应。生信分析证实 circRNA 具有通过与常见的 miRNA 相互作用从而影响 mRNA 表达的能力。高度表达的 circ-EXOC6B 的功能丧失导致许多与 EXOC6B 功能相关过程中大量的 mRNA 表达的改变，提示 circRNA 可以特异性调节与其宿主基因相关的基因。同时发现，尤其是在去极化细胞中，一些 circRNA 与核糖体有关，暗示它们可能被翻译成蛋白质。这些数据支持了circRNA 在修饰与神经元活动相关的基因调控中的作用。

案例三 circRNA作为分子标志物

circRNA的特征可以预败滑测II/III期结肠癌的术后复发[3]

采集20对术后采集的冰冻组织进行 RNA 序列分析，探讨有无复发患者的 circRNA 表达差异。利用临床信息，生成了一个基于四个circRNA的 cirScores 评分，将患者分为高风险组和低风险组。结果发现 cirScores 高的患者比 cirScores 低的患者有更短的无病生存期(DFS) 和总生存期(OS)。功能丧失试验表明，所选的环状 RNA 在结肠癌的进展中起作用。本实验建立的四个基于 circRNA 的分类方式是一个可靠的预测 II/III 期结肠癌患者术后疾病复发的工具，有助于鉴定新的复发特异性分子生物标志物，以期为 II/III 期结肠癌患者提供更好的预后分层和治疗。

参考文献：

[1] Wang S, Zhang Y, Cai Q, et al.Circular RNA FOXP1 promotes tumor progression and Warburg effect in gallbladder cancer by regulating PKLR expres- sion[J].Molecular Cancer, 2019,18(1):145.

[2] Mahmoudi E, Kiltschewskij D, Fitzsimmons C, et al. Depolarization-Associated CircRNA Regulate Neural Gene Expression and in Some Cases May Function as Templates for Translation[J]. Cell, 2020, 9(1), 25.

[3] Ju HQ , Zhao Q , Wang F, et al. A circRNA signature predicts postoperative recurrence in stage II/III colon cancer[J]. EMBO Mol Med, 2019, 11: e10168.