血清外泌体mirna研究套路（血清外泌体和血浆外泌体的区别）

本文目录一览：

• 1、microRNA与血管通透性转移研究套路
• 2、细胞外miRNAs：从生物标志物到生理和疾病的调节因子
• 3、外泌体多组学19-外泌体miRNA分选机制motif研究
• 4、miRNA作为临床诊断标记物具有哪些优点

microRNA与血管通透性转移研究套路

Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis，if=27.407  Cancer Cell.  2014 Apr 14;25(4):501-15. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.00

microRNA可以被肿瘤细胞以外泌体的形式分泌出来，可以与周边的细胞进行crosstalk，进而起到远程调控的作用。可进行crosstalk的周边细胞种类包括：肿瘤微环境中纤维细胞、血管内皮细胞、同类肿瘤细胞等等。本文题目来看，是肿瘤分泌mir-105，作用于远处血管内皮细胞，调节血管内皮细胞屏障功能，而血管内皮屏障作用是肿瘤转移的一个步骤。两个基本内容mir105调节靶基因和肿瘤转移都是很基础的概念，为何能发表于cancer cell这种27分的杂志上穗饥蠢呢？

首先利用研究exosome的方法，证实肿瘤细胞可以分泌exosome，利用检测方法检测exosome内mir-105表达量增高。exosome的研究方法包括：提取分离的方法、电镜观察法、exosome表面特定标志物western检测；microRNA的pcr检测方法。然后验证外泌体内miR-105的生物学功能，需要将肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养，观察血管内皮细胞的连接方式变化；制作乳腺癌动物模型，观察肿瘤转移数目和取血管内皮细胞观察连接方式改变；检测乳腺癌患者血清内miR-105表达水平，观察转移评价指标（DFS）。最后对miR-105调节的靶基因进行验证，靶基因通过网站筛选、双荧光素酶实验验证，验证的靶基因具有调节猜陪血管内皮细胞连接方式的生物学功能；可以行靶基因的rescue实验，证实miR-105调节的充要条件。

首先观察转移性肿瘤细胞和非转移性肿瘤细胞分泌的exosome功能学差异。转移性乳腺癌细胞 MDA-MB-231、乳腺上皮细胞MCF-10A。超速离心法分离exosome，电镜下观察。因为主要证明其与血管内皮细胞的关系，所以通过荧光染色验证人类微血管内皮细胞（HMVECs）可以摄取肿瘤细胞分泌的exosome。荧光电镜和流式细胞仪两种方法检测证实。transwell检测接受exosome后的HMVECs迁移功能的变化。结果显示：转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome，可以被HMVECs摄取，进而影响内皮细胞的迁移功能。那么exosome中哪种成分才是调节迁移的主要分子呢？

通过Solexa深度测序的方法检测转移性exosome和非转移性exosome中microRNA的表达差异，发现基本相同，也列表显示出差异microRNA表。但是最终还是选择了mir-105，而且据说还靶向TJP1：tight junction protein 1紧密连接蛋白（OZ1）。没有交代选择miR-105的标准，一般选差异最明显，作者只是说：we further focused on mir-105。之后选取数十种乳腺癌细胞系，有的是原发肿瘤细胞系，有的是乳腺癌胸腔积液分离出来的转移性细胞系。分别检测的原发瘤细胞和转移细胞系细胞内和exosome中miR-105的表达水平，发现不论是细胞内还是exosome中，在转移性细胞系中miR-105都高表达，提示miR-105是乳腺癌转移特异相关。

进一步验证转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome可以将miR-105转入内皮细胞。分别将MDA-MB-231和MCF-10A分泌的exosome与HMVECs共培养，分别利用PKH67和Cy3标记exosome和miR-105，荧光显微镜下观察不同染色的定位情况。最终证实MDA-MB-231分泌的exosome中miR-105可以转移至HMVECs中，而不是exosome刺激HMVECs产生大量miR-105.

前期的exosome分泌、转移肢伍内容证实之后，下面就对miR-105影响内皮细胞的功能进行深入研究，或者说miR-105调节的靶基因和生物学功能深入研究。我会先做一些生物学功能实验：干扰内皮细胞miR-105表达水平，观察迁移侵袭的变化；如果HMVECs培养能形成微血管，甚至可以观察微血管内皮细胞间距的变化。然后荧光素酶验证靶基因。

首先双荧光素酶实验，验证miR-105可以靶向抑制TJP1基因，之后再在内皮细胞水平，转染miR-105之后，观察内皮细胞OZ-1 mRNA和蛋白的表达抑制。该实验干预内皮细胞内mir -105表达方法，不是使用siRNA或者miR-up等合成化合物，而是直接使用MDA-MB-231分泌的exosome，以及其他各种对照（MCF-10A），还涉及了rescue实验。总之证实了miR-105可以靶向抑制内皮细胞ZO-1蛋白的表达。以下内容为更专业的研究内皮细胞连接的方法。

1、培养基中内皮细胞连接成片，细胞间有细胞连接体。通过免疫染色ZO-1、OOccludin和E-caderin等细胞连接体，后免疫荧光电镜观察这些连接体的表达变化情况。

2、HMVECs细胞间通透性检测，permeablity assay：了解内皮屏障变化的直接效果，利用transwell小室，内皮细胞培养形成平铺一层内皮细胞膜，上层加罗丹明染料颗粒，后可以利用exosome调节内皮细胞的连接松紧程度，观察转入下层的罗丹明颗粒数量。甚至可以测量内皮细胞通透性阻抗electrical Resistance。除了观察罗丹明，还可以GFP标记MDA-MB-231癌细胞，观察癌细胞迁移数目的变化。

3、3D vascular sprout assay，3D培养内皮细胞，形成微血管树，然后给予exosome后，观察测量微血管树的变化，评估exosome对微血管的影响。

除了阐述miR-105的上述生物学功能，更重要的是证实ZO-1是介导miR-105生物学功能的充要条件，需要设计rescue实验，证明恢复ZO-1后，可以逆转miR-105的生物学功能改变。这部分内容不需要单独列出，在阐述mi-105的功能学变化过程中，多加入一组rescue组别即可，因为最终检测的biomarker都是一样的。

以下内容为动物模型水平，验证miR-105的生物学功能。

动物选取NOD/SCID/IL2Rγ null mice，用miR-105含量不同的exosome注射尾静脉处理干预，（exosome from MCF10A/vec (low-miR-105), MCF-10A/miR-105 (high-miR-105), or MDA-MB-231 cells (high-miR-105), or PBS as control）。 动物模型如何评估血管通透性和肿瘤转移性。

动物模型静脉注射染料罗丹明，观察肿瘤常见转移器官肺和脑组织中罗丹明渗透情况，如果肺或脑组织中罗丹明染料增多，提示血管通透性增加。

动物模型，评估肿瘤转移性，最常见的指标是转移瘤数目或大小。而本文则将移植瘤细胞首先利用荧光标记，然后在心内注射形成移植瘤，3周之后，提取肺和脑组织中荧光基因的表达量，表达量越高提示转移瘤负荷越大。

当然，肝肺组织病理切片，含量不同miR-105处理干预之后，免疫荧光染色观察OZ-1及occludin等细胞连接蛋白表达情况也可间接说明问题。（CD31染色提示血管结构，观察血管结构内OZ-1连接蛋白表达降低）。

之前都是利用mir-105含量不同的exosome做干预，观察血管通透性和转移瘤负荷。那么原发瘤中miR-105高表达后，是否能起到同样的作用呢？首先制作高表达miR-105的移植瘤模型，选取 an MCF-10A-derived tumorigenic line, MCFDCIS, which forms lesions similar to comedo ductal carcinoma in situ that spontaneously progress to invasive tumors为细胞模型，检测细胞miR-105表达含量、细胞内ZO-1表达水平，以及细胞的迁移和转移属性，证实模型成功。之后同上一部分，检测罗丹明染料评估血管通透性、检测荧光基因评估转移瘤负荷，以及病理切片ZO-1染色。结果证实原发瘤高表达miR-105，同样可以抑制肺脑组织ZO-1表达、增加血管内皮通透性、促进肿瘤转移。

为了证实，miR-105抑制剂能否逆转上述生物学功能变化，具有治疗意义。动物模型制备同上一部分，干预处理措施为：尾静脉注射anti-mir-105，检测指标同上。结果显示anti--miR-105具有治疗意义。

检测瘤组织和血清mir-105表达水平，是否具有一致性，以及miR-105与ZO-1具有负相关，回顾性分析转移瘤和未转移瘤患者血清miR-105表达水平，高表达者发生转移率更高。或者生存分析预后。

microRNA研究套路：细胞生物学功能、靶基因验证及介导功能的必要性、动物模型试验，最后在临床病例寻找证据，支持机制研究结论。这是基础研究的逻辑方式，首先在分子机制研究透彻了，然后找临床数据支持。而临床研究逻辑则相反：首先发现有临床现象和临床数据支持，然后在深入探讨细胞和动物水平有没有该现象，如果有的话，最后深入探讨分子基因互作机制。另外研究血管通透性相关转移，可以参考该文的实验方法。•

参考资料：

NOD/SCID/IL2γ null mouse：

 NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。

• Prkdcscid ：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T和B细胞缺失 ，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。

• Il2rgnull： Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。

B- NSG 小鼠 ：综合了NOD-SCID-IL2rg背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。

优点

• 迄今世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠；

• 与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年；

• 对人源细胞和组织几乎没有排斥反应；

• 少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型；

细胞外miRNAs：从生物标志物到生理和疾病的调节因子

原文链接： Cell Metabolism 30, October 1, 2019. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. IF: 22.415

miRNAs可在血清和其他体液中发现，并可作为疾病的生物标志物。更重要的是，分泌型miRNAs，尤其是胞外囊泡(EVs)如外泌体分泌的miRNAs，可能介导不同组织间的旁分泌和内分泌通讯，从而调节基因表达和远程调控细胞功能。分泌型miRNAs受影响时可能会导致组织功能障碍、衰老和疾病。 脂肪组织是循环外泌体miRNA的重要来源。 在许多代谢条件下发生的脂肪组织质量或功能的改变可以导致循环miRNA的改变，从而引起机体一系列的功能改变。

这篇综述回顾了得出这些结论的研究，并讨论了如何为新的研究奠定基础，有助于进一步确定细胞外miRNA作为细胞间通讯的重要介质如何发挥强大作用。

综述分为以下几个部分：

MicroRNAs (miRNAs)是由体内各种细胞产生的约22个nt的调节性非编码小RNA。许多埋盯miRNAs在进化过程中高度保守，尽管它们的多样性和数量与机体的复杂性相关。秀丽隐杆线虫的基因组包含437个miRNAs，小鼠超过1500个，而人类的miRNAs在2000到3000个之间(数据来自miRBase，第22版)。许多miRNAs可以无所不在地表达，而其他的则具有组织特异性。这种分布模式是由细胞内miRNA前体的转录和转录后调控所驱动的。

在细胞核中，初级miRNAs(pri-miRNAs)被RNA聚合酶II转录，然后由微处理器复合物(内含核糖核酸内切酶DROSHA及其RNA binding partner DGCR8)或剪接机制的组件进行处理。这导致了约70个nt的pre-miRNAs，被XPO5和Ran GTPase输出到细胞质中。pre-miRNAs被III型核糖核酸内切酶DICER和RNA结合蛋白TRBP与PACT共同处理，产生双链miRNAs duplex。这些miRNAs duplex被加载到RNA诱导的沉默复合体（RISC），在RISC中，Argonaute-2 (AGO2)及其分子伴侣HSC70/HSP90介导双链miRNAs duplex的一条链与其靶mRNA结合（另一条链一般很快被降解了），抑制mRNA的翻译和/或加速mRNA的降解。也有一些miRNAs发挥非常规的相反作用：诱导转录和上调蛋白表达的。不弯胡和依赖DICER的miRNA生成也有报道，但它们的影响有限。

与mRNAs类似，miRNA表达谱也可作为细胞标志物。例如，miR-122在肝脏中高度表达，占该组织中总miRNA表达量的70%。肌肉细胞中富含miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-486和miR-499，因此这些miRNAs被称为myomiRs；miR-9和miR-124几乎完全在大脑中表达，后者占了该组织中近50%的miRNA含量；而β细胞是唯一高丰度表达miR-375的细胞。另一方面，一些细胞，如脂肪细胞和干细胞，表达多种miRNAs。

为了理解miRNAs 的表达如何在特定细胞类型中促进该组织的发育和稳态，产生了多种 细胞类型特异性DICER或DGCR8敲除小鼠 。中枢神经系统、胰腺、骨骼肌和心肌的DICER敲除使小鼠不能成活或出现严重的发育缺陷。而肝脏特异性DICER敲除小鼠(LDicerKO)和脂肪细胞特异性敲除小鼠DICER (ADicerKO)或DGCR8 敲除小鼠(ADgcr8KO)在成年之前与野生型的幼鼠难以区分，直到它们开始出现代谢功能障碍。包括LDicerKO小鼠肝脂质沉着症和早发性肝细胞癌；ADicerKO和ADgcr8KO小鼠部分出现脂肪营养做迹不良和胰岛素抵抗。许多表型是因为miRNAs生成受阻改变mRNA半衰期和细胞的翻译功能，但是有一些表型因为其他组织中基因表达和功能的变化引起的二级改变，提示细胞非自治组织miRNAs损失的影响。当ADicerKO小鼠移植正常脂肪组织后，其肝脏基因表达发生逆转，提示这些变化受脂肪组织分泌的miRNAs调控。这种现象产生一个假象：每个细胞的miRNAs是内源性miRNAs产生和外源性miRNAs摄取的总和。要证实这一假设，就需要发展稳健的技术来追踪miRNAs起源和运输。

miRNAs可以通过囊泡转运和蛋白载体的机制被细胞输出和导入是miRNAs具有潜在的细胞和组织间通讯作用的强有力支持。这个概念最早是由Valadi等人在 2007年 提出的，他们在不同细胞系分泌的胞外囊泡(EVs)中识别出大量的mRNAs和miRNAs，这些囊泡可以被其他细胞吸收，然后将mRNAs和miRNAs释放到靶细胞中。 2010年 有研究表明，体液中存在miRNAs，且它们的水平与疾病进展相关。从那时起， 细胞外miRNAs转运机制 被广泛研究，目前已知 的两条主要途径 是： (1)通过EVs主动转运；(2)作为蛋白-miRNA复合物的一部分转运 。此外，可能有一些miRNAs是从破损或受损的细胞中泄漏出来的。

通常，多泡体(MVBs)与质膜融合产生的较小的EVs ( 200nm )称为外泌体(图1)，而质膜直接向外出芽和裂变形成的较大EVs ( 200nm )称为微囊泡。直接出芽也能产生类似外泌体的小泡，被称为梭状囊泡或胞外体。

除EVs外，miRNAs还可能在含有蛋白复合物的血液中被运输。这些复合物也可以进入细胞并传递miRNAs来抑制靶mRNA。 低密度(LDL)和高密度(HDL)脂蛋白 都可以在循环中运输miRNAs。在HDLs的情况下，结合的miRNAs可以通过B类I型清道夫受体被受体细胞吸收并在细胞内释放从而调节受体细胞基因表达。

尽管EVs相关和脂蛋白结合的miRNAs在功能上很重要，但它们只是占循环中发现的所有miRNAs的一部分。在一些研究中，在人类血清中发现超过一半的miRNAs可能与核糖核酸蛋白结合，包括argonaute ( AGO2 )；然而，其中只有一小部分是通过这种方式运输的。核仁蛋白核磷蛋白1 (nucleophosmin 1, NPM1 )也被发现可以携带和保护细胞外miRNAs不被降解。

生物标志物是一种可以用于疾病检测和/或预后预测的分子。一个好的生物标志物最重要的四个特征是特异性、敏感性、稳定性和非侵入性。 循环miRNAs水平的变化与多种疾病相关，包括2型糖尿病(T2D)、肥胖、心血管疾病(CVD)、癌症、神经退行性疾病等。

这部分内容参考我写的 ChemicalReviews综述 ，那里面有更详细的描述。

脂肪组织的功能除了以甘油三酯的形式储存能量外，还能分泌调控全身新陈代谢的分子来维持机体内环境平衡。这些分子包括脂肪产生的激素(被称为脂肪因子)，信号脂质，炎症介质和EVs miRNAs。 ADicerKO小鼠约三分之二的循环miRNAs显著减少，这表明了脂肪组织对循环miRNAs库的显著贡献。 患有各种脂肪营养不良的患者，其循环外泌体miRNAs也有显著改变。重要的是，脂肪组织分泌的miRNAs已经被证明可以到达肝脏和肌肉等器官，并调节该组织基因和蛋白质的表达。

脂肪来源的循环miRNAs以内分泌方式控制代谢稳态的一个例子是2017年Thomou等人通过脂肪来源的miR-99b调控肝脏FGF21。 ADicerKO小鼠循环EVs中的miR-99b水平降低，肝脏中Fgf21 mRNA及3' UTR-报告基因活性的上调，这两种现象可通过往循环中加入含有 miR-99b 的EVs显著纠正。ADicerKO小鼠还显示出其他组织(包括肌肉、β细胞和骨骼)功能障碍，以及全身胰岛素抵抗。 但具体是哪些循环外泌体miRNAs参与了这些表型仍有待确定。

其他研究表明，来源于脂肪EVs的miRNAs也可以发挥旁分泌功能。从含有 miR-16、miR-27a、miR-146b和miR-222 的大脂肪细胞中释放的EVs可以转移到小脂肪细胞中，从而刺激其脂肪生成和脂肪细胞肥大。脂肪细胞分泌这些miRNAs是由游离脂肪酸和H 2 O 2 诱导的，在老年小鼠的血清中这些miRNAs表达上调。这些结果提示促进脂质积累和胰岛素抵抗的信号可能通过脂肪细胞的分泌miRNAs从胰岛素抵抗的脂肪细胞向新形成的脂肪细胞传播。肥胖患者的多种脂肪组织衍生的循环miRNAs(通过含脂肪特异性蛋白FABP4的细胞外颗粒的亲和纯化鉴定)在减肥手术一年后发生了显著变化。估计这些miRNAs可靶向WNT/β-catenin和胰岛素信号通路的成分。减肥手术后差异表达的miRNAs中， let-7a和miR-16 的靶标涉及胰岛素受体信号传导，并且这些miRNAs的水平与支链氨基酸（BCAA）的水平相关，表明它们可能与全身胰岛素抵抗相关。

胰岛细胞不仅可以通过分泌胰岛素和胰高血糖素来控制代谢，还可以通过分泌miRNAs来控制代谢。 初级胰岛细胞和β细胞来源的MIN6细胞在收到胰岛素分泌刺激时可释放特定的miRNAs。例如，与瘦组相比，肥胖ob/ob小鼠的血清、胰岛、肝脏和骨骼肌中 miR-223 表达上调。但其前体pri-miR-223仅在胰岛中升高，这表明其他组织中成熟miR-223水平升高来源与胰岛。miR-223已被证明能与 Glut4 mRNA的3' UTR结合，下调脂肪组织中的GLUT4( 葡萄糖的代谢取决于细胞对葡萄糖的摄取，然而，葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，细胞对葡萄糖的摄入需要借助细胞膜上的葡萄糖转运蛋白（glucose　transporters）简称葡萄糖转运体（GLUT）的转运功能才能得以实现。GLUT4就是其中的一种形式 )，上调心肌细胞的GLUT4表达。

miR-155、miR-142-3p和miR-142-5p 可能从T淋巴细胞来源的EVs转移到β细胞，导致炎症通路、细胞凋亡的激活和胰岛素缺乏性糖尿病的发生。

人单核细胞在促炎刺激后分泌的EVs具有高水平的 miR-150 。用这些EVs孵育微血管内皮细胞可下调miR-150靶基因c-Myb，这是一种参与内皮细胞迁移的转录因子。miR-150在体外过表达可诱导内皮细胞迁移，这种作用可通过动脉粥样硬化患者（miR-150水平上调）血浆中的EVs孵育来模拟。来自血管平滑肌细胞的EVs已被证明能够促进 miR-155 向内皮细胞的转移，通过降低紧密连接蛋白的水平来影响内皮屏障的完整性。暴露于氧化的低密度脂蛋白（LDL）的内皮细胞分泌的EVs高表达miR-155，miR-155可以将巨噬细胞的极化从M2样表型转移到促炎性M1样表型。血清和心脏中 miR-126 水平的变化被认为通过影响MCP-1和VCAM-1的表达而在心功能障碍中发挥作用。这些过程改变内皮功能，促进动脉粥样硬化。

越来越多的证据表明，循环EVs可能穿过室管膜层和血脑屏障(BBB)作用于中枢神经系统，从而发挥组织间通讯的作用。老龄大鼠鼻腔给药含 miR-219 的血清EVs可增加中枢神经系统的髓磷脂含量。改变血脑屏障(BBB)通透性的神经退行性疾病可以促进大脑循环miRNAs与血液循环miRNAs的交换。也有证据表明 EVs可以通过胞吞机制穿过血脑屏障 。许多细胞外miRNAs被认为是神经退行性疾病的疾病生物标志物，尽管它们在这些疾病的病理生理学中的作用尚不确定。 衰老会影响下丘脑干细胞分泌EVs miRNAs，而脑室内注射下丘脑干细胞分泌产生的EVs能够延缓下丘脑衰老。（汤老师的Nature文章） 含有miRNAs的EVs也涉及神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞之间的相互作用。2018年，Huang等人发现脑损伤后小胶质细胞EVs 中miR-124水平升高，观察到这个miRNA可以转移到神经元中发挥抑制神经元炎症和促进神经元突触生长的作用。

尽管这个领域还很年轻，但细胞外miRNAs作为细胞间通讯的生理机制的概念却令人兴奋并受到关注，使用细胞外miRNAs更好地对疾病分期以及治疗的前景也是如此。目前，开发合适的工具和标准化的方法来评估miRNAs的运输和交付是该领域的瓶颈，但是在未来几年可能被克服。克服这些障碍将把这一领域带入一个新的高度：特定的细胞外miRNAs可被视为不同生理和病理生理状况的生物标志物，而外泌体或其他EVs中的miRNAs可被用于以一种特定而有效的方式治疗疾病。

感觉这篇综述的质量不如我写的上一篇 ChemicalReviews综述 ，那篇更全面，并且对某些方面描述也更具体。不过这篇也可以学到少量那篇综述没涵盖到的知识点。

原文链接： Cell Metabolism 30, October 1, 2019. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. IF: 22.415

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外泌体多组学19-外泌体miRNA分选机制motif研究

外泌体和其他小的胞外囊泡(sev)提供了一种独特的细胞间通信模式，在这种模式中，从一个细胞产生和释放的microrna(miRNAs)被远处的细胞吸收，在那里它们可以引起基因表达的变化。然而，mirna被分选到外泌体/sev或保留在细胞中的机制仍在很大程度上未知。

在这里，我们证明了miRNA具有分选序列，决定其在sEV（EXOmotifs）或细胞保留(CELLmotifs)中的分泌，并且不同的细胞类型，包括白色和棕色脂激码肪细胞、内皮、肝脏和肌肉，优先使用特异性分选序列，从而定义该细胞类型的sEVmiRNA谱。

为了研究miRNA细胞保留和外泌体/sEV释放的具体特征，我们从5个小鼠细胞系中分离出了外泌体/sEV，这些细胞系代表了参与代谢调节的重要组织：

不同类型的细胞释放不同数量的sev，3T3-L1脂肪细胞的产生和释放率最高，C2C12肌管的释放率最低；这与观察到的脂肪组织是体内循环外泌体/sEVmirna的主要贡献者相一致

在所有病例中，sev的直径为50-200nm。

富集经典的外泌体标记物ALIX、TSG101、CD9和CD63，而细胞标记物GM130和CANX基本没有

这些sev的RNA含量与释放的囊泡总数相平行

使用基于实时荧光定量PCR(qPCR)的阵列评估分泌的sev及其来源的细胞的miRNA组成(图1a)。与预期的一样，细胞miRNA的主成分分析(PCA)显示，尽管棕色和白色的脂肪细胞和内皮细胞聚集在一起，而肝细胞和肌细胞更为不同，但每种细胞类型都有不同的miRNA谱。

当PCA同时包括细胞和sEVmiRNA时，sEVmiRNA彼此之间以及与其来源细胞中的miRNA有很大的不同(图1b)，突出了miRNA分泌的特殊性

然后，我们比较了每种细胞或sEV类型中每个miRNA与其他类型的水平。在细胞体中评估的664个miRNAs中，有210个miRNAs（32%）在一种细胞类型中的表达明显高于其他四种细胞类型

同样，与其他细胞类型的囊泡相比，大约三分之一的sEVmiRNAs（218/660）在一种细胞类型的囊泡中富集，可用于预测来自不同器官的混合sev中的组织来源，如在血液中。

一些sev特异性的miRNA反映了miRNA的细胞类型明敬哪特异性，例如，miR-133a/b，它在C2C12肌管中特异性表达。

然而，对于每种细胞类型，73-92%的被认为是针对特定细胞类型的sEVmiRNAs也在其他细胞类型的细胞体中以类似或甚至更高的水平表达，提示了一种细胞类型特异性的分类机制。同样地，在两种不同细胞类型的sev中同样丰富的miRNA在两种分泌细胞类型中可能有相当不同的表达水平。因此，确定sEVmiRNA的组织起源并不像知道miRNA在哪个组织中高表达那么简单（上图e）。

通过比较细胞体中每个miRNA与sev的相对水平可以揭示miRNA分泌和保留的独特模式。

与细胞体相比，一些mirna在所有五种细胞类型的sev中均富集，而其他的则在只有稿胡一种或两种细胞类型的sev中表现出选择性富集，还有一些发现在sev中很少或根本没有发现，尽管它们存在于细胞体中。

将sEV中miRNA的相对丰度除以其在细胞体中的相对丰度(sEV富集)，表明sEV和细胞中miRNA的分类存在大量差异，一些miRNAs在sEV中明显富集，而另一些在细胞体中明显富集（保留）.

为了确定miRNA分选的潜在机制，我们分析了显示sEV或细胞体富集的miRNA的miRNA序列和结构。5p和3pmiRNAs没有普遍富集（补充表6）。然而，与细胞中保留的序列相比，sEV富集水平更高的miRNA序列具有更高的G+C含量和更低的吉布斯自由能(ΔG)(扩展数据图2c，d).

识别潜在的差异分选miRNAs序列，我们分析在sEV或细胞体中富集的miRNAs的序列，将它们与未显示出优先sEV分选或细胞保留的mirna序列进行比较。

miRNA作为临床诊断标记物具有哪些优点

你问：miRNA作为临床诊断标记物具有哪些优点；1、临床诊断标记物miRNA的异常表达与卵巢癌的演进有着密切联系。循环miRNA在血清中稳定存在,具有较好的组织特异性,成为卵巢癌无创诊断的戚指闷一个新靶标。

2、循环miRNA是液体活检研究领域的一个重要方向,尤其在外泌体的概念发展以后,丰富了对循环miRNA的认识和检测方式。现对循环miRNA在卵巢癌中的生物学和临床诊断标记物意义进行综述。

3、研究发现部分血清miRNA与胃癌密切相关,但对早期胃癌的研究较少见.目的：探讨血清miR-1、miR-20a、miR-27a、miR-34a、miR-423-5p表达在胃癌尤其是早期胃癌诊断中临床诊断标记物的价值和方法。

4、采用临床诊断标记物qRT-PCR法检测180例胃癌患者（包括149例进展期胃癌和31例早期胃癌）、49例癌前变化患者、57名健康对照者的血清miR-1、miR-20a、逗稿miR-27a、miR-34a、miR-423-Sp表达.采用ROC曲线判断miRNA的诊断敏感性和特异性.结果：胃癌患者血清miR-1、miR-20a、miR-34a、miR-423-5p表高弯达显著升高（P＜0.05）,ROC曲线下面积（AUG）分别为0.894

9、0.814

8、0.6448、0.589

7,四者联合的AUC为0.921

1,敏感性和特异性分别为85.8％和83.3％.早期胃癌中miR-1和miR-20a的表达明显升高（P＜0.05）,AUC分别为0.813

8和0.774

2,两者联合的AUC为0.865

3,敏感性和特异性分别为80.5％和83.6％.进展期胃癌中miR-1的表达显著高于早期胃癌（P

=0.012

1）,且术后表达明显降低（P

=0.018

5）。

6、结论：miR-1、miR-20a、miR-34a、miR-423-5p可作为肿瘤标记物对胃癌进行诊断,miR-1、miR-20a可作为诊断早期胃癌的标记物.