酵母双杂交培养基（酵母双杂交技术方法）

本文目录一览：

• 1、酵母双杂交实验有哪些注意事项
• 2、酵母双杂实验为什么要用二缺三缺的培养基
• 3、酵母双杂交，bait如何构建
• 4、酵母双杂交x gal培养基中加入aba为什么
• 5、我做酵母双杂交的菌种AH109最近在YPD培养基上培养，菌落是白色还是粉红色的呢?要是被污染了这么鉴定呢？

酵母双杂交实验有哪些注意事项

注意事项

（1）酵母双杂交对照的设定 常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统为例：

阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，早汪郑其中T蛋白和53蛋陵吵白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。

阴性对照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合。 系统显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。

（2）假阳性现象 多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种：

筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达——这种情况需要对筛陆颂到的候选蛋白进行自激活验证。

酵母细胞内可能同时含有不止一种文库蛋白，其中的一种文库蛋白可以与诱饵蛋白相互及结合。

这种情况需要对阳性克隆再次划板2~3次，以确保每一个酵母克隆中只含有一种文库蛋白和诱饵蛋白；另外划板的次数也不宜过多，否则会出现蛋白表达质粒丢失的情况。 其他一些不明原因造成的假阳性—这种情况需要将筛到的候选文库质粒和表达诱饵蛋白的质粒重新共转入酵母细胞或者通过酵母杂交的方式重新验证，如有必要可以将pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒的载体对调构建成pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新在酵母细胞中验证，真正的阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。

（3）常见的问题及参考方案 转化效率过低—尽量使用新鲜的培养基以及新鲜的、且直径大小在2~3 mm左右的酵母克隆，以确保酵母的活力；可将用于转化的质粒在使用前进行乙醇沉淀，以提高质粒的纯度和浓度。

杂交效率偏低—可能由于表达的融合蛋白对酵母细胞有毒性，在某些情况下在液体培养基中生长不好的酵母换到琼脂糖固体培养板上时，会生长得比较好，这种情况可以采用共转化的方法进行试验；或者将单转的酵母克隆分别铺到5块10 mm的培养板上，待克隆长出来以后，刮取所有克隆于5 mL 0.5×YPDA中。重悬后再按照常规杂交操作步骤进行操作。 背景过高—当使用HIS3作为报告基因时，由于HIS3基因具有一定程度的泄漏表达，可能会出现背景过高的情况，这时可以使用适量的HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一种更加严格的报告基因的筛选如Ade。

诱饵蛋白具有自激活现象——可以采用克隆突变的方法将产生自激活一段氨基酸序列敲除或突变，但这种方法可能会破坏两蛋白之间的相互作用。

酵母双杂实验为什么要用二缺三缺的培养基

是酵母遗传学、细胞与分子生物学实验室的最佳选择，泛基诺产品驰名全国，享誉世界，其酵母选择营养培养基/缺素培养基广泛应用于酵母遗传、基因工程以及工具方法学（酵母双杂交、酵母单杂交）和动物、植物基因功能互补实验等的研究中，涵盖酵母研究的一切主要方面和一切主要过程。

分类导航：营养缺陷型标记基因的筛选和酵母转化、外源基因在酵母中的表达。

酵母SD培养基-SC/Dropout-酵母营养缺陷型筛选标记-酵母组成型表达质粒启动子ADH/ADC/PGK与诱导型表达启动子GAL1及其选择营养缺陷标记基因。

泛基诺(FunGenome)二缺培养基：此类酵母SC选择培养基－SD培养基用于双质粒酵母转化筛选。

用途：外源基因在酵母中的表达：异源基因功能互补（参见泛基诺博文基因功能研究系列）、酵母单杂交系统（参见泛基诺《转录因子研究的夏日玫瑰》一文）和酵母双杂交系统（参见泛基诺《神奇的酵母尘滚薯遗传学》三篇系列文章）初始质粒转化。

免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation)、Y187和AH109 酵母交配实验、接合型二倍体筛选。基诺(FunGenome)三缺培养基：此类酵母SC选择培养基－SD培养基用于双质粒酵母转化筛选和报告基因检测。

扩展资料：

培养基配制方法注意事项

1、上述培养基含有各种所需成分(葡萄糖除外, 因为有些研究者需要用其他糖类如用半乳糖诱导GAL1启动子表达), 为各种氨基酸和酵母含氮碱/酵母氮源的精细混合物干粉，按照8g/L称取, 加水后即可配制成相应的培养液, 无需再购置添加Minimal SD Base或其他酵母氮源成分。

高压灭菌后加无菌葡萄糖至终浓度为2％(或棉子糖)或实验所需的特定诱导物(如半乳糖用于GAL1启动子诱导表达的剂量或浓度为2%)即可, 适用于外源基因在酵母中的表达，派者酵母单杂交(yeast one-Hybrid)和酵母双杂交(yeast two-Hybrid)系统等的选择缺陷型培养。

筛选含特定标志基因的酵母表型。有关酵母表型与选择标记基因的理论问题可发电子邮件到 fungenome@126.com进行详细咨询。

2、在配制酵母缺陷培养基时，可以先加入葡萄糖后再高压，对酵母的生长不会产生严重影响。但如加入葡萄糖后再高压消毒则培养基会变色，由浅黄到深褐色不等，对细胞的生长还是有一定影响的（但在一般情况下不会影响实验）。

FunGenome suggestion: 由于氨基酸和葡萄糖在高温高压下可起化学反应，因此泛基诺技术部不建议将葡萄糖加入后高压，而备贺建议用上述提示1的方法配制。

3、FunGenome suggestion : 棉子糖和半乳糖原则上是不能高温高压的，因为在高温高压下其化学结构会发生变化从而对诱导效果产生抑止，这一点特别提醒研究者务必注意，尤其是在做表达调节介导的功能互补实验时至关重要。

4、制备平皿即软琼脂半固体培养基（琼脂粉按2％即每100ml加2克琼脂粉）用于转化筛选时，高压前需要将pH调至6.0左右（为方便起见，pH范围可在5.6-6.5之间变化），而液体培养基则不需要调pH。

酵母双杂交，bait如何构建

可参考：诱饵基因转化筛库宿主菌Y190

1） 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)，

OD600 达到1.2 左右。

2） 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定培棚)YPD 中培养4 小时左右，使

培养液OD600 达到0.6。

3） 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1，

865rpm)，5 分钟离心收集菌体，弃上清。

4） 20ml ddH2O 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分钟离心收

集菌体，弃上清。

5） 20ml 1XTE/LiAc*重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R ，700g，5 分钟离

心收集菌体，弃上清。

6） 根据每个转化需要50μl 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到

Eppendorf 管中，每管50μl 菌液。

7） 每管加约100ng Bait 基因质粒，5μl 预变性的Carrier DNA*，500μl 1X

TE/LiAc/PEG*。

8） 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。

9） 30 分钟后，每管加入15μl DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE)，轻轻宴坦上下颠

Bait 基因的自激活检测

一般采用膜检的方法，检测LacZ 基因的表达情况。膜检方法如下:

1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。

2) 将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30 秒，取出后晾干。

3) 培养皿加入适量显色液*(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶

后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm 培养皿加2ml 显色晌中桐液，15cm

培养皿加5ml 显色液。

4) 盖上皿盖，放置在37℃培养箱中，避光放置。

5) 20 分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3 小时为准，特殊情

况下可以看过夜是否变蓝。

6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。

35cycles

酵母双杂交x gal培养基中加入aba为什么

酵母双杂交x gal培养基中加入aba为什么虚坦

亏碧发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因，如广泛采用的HIS3基因。经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞，只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因，其中之一是 LacZ。这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点，因此可以被相同的转录激活因子（如上述的Gal4蛋白）激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进，这里不一一详述。

在双杂交鉴定过程中要经过两次转化，这个工作量是相当大的，特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且，酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用，避免了两次转化操作，同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型，这两种单倍体之间接合（mating）能形成二倍体，但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点，他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞，“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔（lawn），再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上，原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但BD融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了差空桐实验操作，而且也提高了双杂交的筛选效率。

我做酵母双杂交的菌种AH109最近在YPD培养基上培养，菌落是白色还是粉红色的呢?要是被污染了这么鉴定呢？

菌落变粉一般不是污染，是Yeast genetics中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后空掘，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，斗银核代谢途径请见。然而，AH109经过ADE2基因敲除，Adenine合成途径被阻碍。又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成P-ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

粉红色菌落在Y2H实验中不会造成问题，只是因其细胞中缺乏Adenine致使生长速度较白色菌落略缓。在培养基中添加过量Adenine会解决此问题，但搏扒并无太大必要。