细胞冻存液配方5:4:1（细胞冻存液配方721）

本文目录一览：

• 1、原代细胞冻存基本技术哪位能介绍一下啊
• 2、求细胞冻存液的主要作用及成分。越全越好。。
• 3、细胞冻存的操作步骤是什么？
• 4、细胞冻存液怎么配
• 5、配细胞冻存液
• 6、细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

原代细胞冻存基本技术哪位能介绍一下啊

原代细胞冻存基本技术 1、选用原代细胞生长状态好(90-95%)，生长数量大于5×105进行冻存。 2、原代细胞冻存24小时，须换液新鲜原代细胞培养液一次。 3、贴壁的原代细胞需常规用0.25%胰酶粗御消化，将消化后的细胞悬液收集至细胞离心管中。 4、细胞离心管在1000rpm下离心5分钟培凳慎，小心弃清液。 5、将细胞冻存液加入细胞离心管中，悬浮细胞。细胞计数调整至5×105/ml。 6、将悬浮细胞放置细胞冻存管中。密封细胞冻存管。 标明细胞种类和冻存日期。 请记住：封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 请按下列顺序降温保存原代细胞：室温→4℃(20 分钟)→ 冰配敬箱冷冻室(30 分钟)→ 超低温冰箱(-80℃过夜)→ 液氮。 原代细胞冻存液常用配方：70%完全原代细胞培养液(不含有血清、添加剂、双抗)+ 20%胎牛血清 + 10%DMSO 只是简单的介绍了一下，更详细的介绍可以到生物帮那里了解啊，希望我的回答可以帮到你 有空的话可以去 详细的了解一下。 那里信息内容丰富、科学、专业，希望对你有帮助。

求细胞冻存液的主要作用及成分。越全越好。。

作用：可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。

渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。

冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的神源浓度，使细胞免受溶质的损伤。

渗透性冷冻保护剂的保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之知册前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。

扩展资料：

保护剂使用注意

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存搭瞎宏前一天最好换一次培养液。

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。

3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

参考资料来源：百度百科——冻存保护剂

参考资料来源：百度百科——细胞冻存

细胞冻存的操作步骤是什么？

1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3、去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4、离心1000rpm，5min；

5、去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

6、细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8、冻基举存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存搏局碧管，移入液氮容器内。

注意事腊弯项

1、从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞用于冻存，最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2、将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3、冻存和复苏最好用新配制的培养液。

细胞冻存液怎么配

10%-15%（常见为10%）的DMSO或甘油，含10%-20%血清的冻存培养液。

一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提租判供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞。

有人亲测10%血清冻存细胞，结果证明是可以的，但高血清比例的冻存液更有助于提高细胞活力，此外娇贵的细胞可以适当提高冻存液中血清的比例以保证获得更高的存活率及活力。

扩展资料

细胞冻存和复苏的原则：

慢冻速融，这样坦举更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。

常用的冻存保护剂为二甲基亚砜（DMSO）和甘油，冻存细胞时加入保护剂，一方面可以提高细胞膜对水的通透性，另一方面使冰点降低，延缓冻结过程。

缓慢冻存细胞的过程中，加入保护剂可以使让型碧细胞内水分渗出到细胞外，一定程度上减少胞内冰晶的产生，而在快速复苏细胞的过程中，能使胞外冰晶迅速融化，防止水分渗入胞内再次形成冰晶而损伤细胞。

参考资料来源：百度百科-细胞冻存

配细胞冻存液

细胞冻存

1.预先配制冻存液键晌：10

%

dmso

+

90%胎牛血清,4℃冰箱保存预冷；

2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基,pbs冲洗两次,用胰酶消化细胞（尽可能温和）；

3.再次用完全培养液悬浮细胞,将预冷的冻存液加入消化掘袭完全的细胞中,用滴管轻轻吹打混匀.

4.在每支冻存管中加入1ml细胞液,密封后标记冻存细胞名称和冻存日期.

5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力,如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜,放入液氮罐）最好；判亮兄或者可以在4℃,2h；然后转到-20℃,2h；-80℃,2h；放入液氮罐.

这是我实验中用的protocol,

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

具体步骤：

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。

加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证枝悉姿温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要求：

1．无菌环境

无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。

3.适宜的渗透压

高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。

4．气体环境与pH

细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。

注意事项：

（1）第一次开始培养某种细胞时，一定要在WWW. ATCC. ORG上用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。

（2）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照步骤操作。

（3）预防细胞污染

（4）防止细胞交叉污染

扩展资料：

动物细胞培养：

在所有的细胞离体培养陆告中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。

⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最猛绝常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。

⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。

参考资料：细胞培养-百度百科