冻存细胞血清和dmso的比例（冻存细胞dmso浓度）

本文目录一览：

• 1、细胞冻在-80冻和液氮冻的区别
• 2、如何冻存细胞
• 3、细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
• 4、求细胞冻存液的主要作用及成分。越全越好。。
• 5、细胞冻存液怎么配
• 6、细胞冻存的操作步骤

细胞冻在-80冻和液氮冻的区别

一般认为现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，而这些技术的发展几乎都离不开细胞培养技术，特别是医药领域的发展，细胞培汪棚册养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用，而细胞冻存又是细胞培养不可或缺的一步。

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术，它一般包括复苏、传代及冻存，这里增添了驯化的步骤，主要是为了得到我们需要的目标细胞，如将贴壁细胞驯化为可悬浮培养的悬浮细胞等。

通常情况下细胞实验周期较长，所以总免不了要冻存一部分细胞以备后用，那我就来说下冻存时的操作步骤和注意细节:

细胞冻存

1、为什么要进行细胞冻存？

细胞培养过程会出现污染或者有些细胞经长期传代培养后可能被诱导分化，而这时之前冻存的细胞就是重新来过的“火种”，避免全军覆没的危险；同时细胞冻存还能节省实验室空间、经费及时间成本；最重要的是确保实验的一致性和连贯性。

2、保护剂的分类？

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶困宏，从而引起一系列不良反应。如细胞外形成冰晶会因为脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱；如细胞内冰晶形成较多会造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

图 有无细胞外冰晶形成（左：有；右：无）

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。在细胞冻存的过程中用来保护细胞而添加的保护剂一般分为渗透型如甘油、二甲基亚砜（DMSO）或甲醇等，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内冰晶的形成，从而减少对细胞的损伤。另一种是非渗透型的保护剂剂，一般是些大分子物质，主要包括聚乙.烯吡.咯烷酮（PVP）、蔗糖等，可保护细胞免受伤害，提高细胞活率。

3、细胞冻存要什么？

超低温冰箱或液氮罐

0.25%胰蛋白酶

20%以上血清的完全培养液或血清

DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒)

专用细胞冻存管，程序降温盒

吸管、离心管、喷灯、冻存管架

4、细胞冻存怎么做？

图 细胞冻存

细胞收集

贴壁细胞：选择处于对数生长期的细和手胞，将培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。去掉胰蛋白酶后加入适量培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液后离心。

悬浮细胞：直接将细胞收集到离心管后离心

保护剂添加

去上清，加入含20%以上小牛血清的完全培养基或血清，于4℃预冷15分钟后，加入10%的DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装于细胞冻存管，细胞浓度为3×10^6～1×10^7cells/ml之间。将装有细胞悬液的冻存管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记。

细胞冻存

细胞冻存一般是慢冻：先将冻存管置入置于4℃ 30-40 min，再转入-20℃ 2h后，再放入-80℃冰箱冷冻过夜后保存到液氮罐中。

图 Genever冻存管及程序降温盒

目前更多使用程序降温盒，将细胞冻存管放于盒内，直接置于超低温冰箱，程序降温盒可控制每分钟下降1℃。

1.拧开冻存盒；2.抽出支架；3.加入异丙醇；4.支架放回冻存盒中；5.放入冻存管；6.拧好盖子放入-80℃冰箱保存4h。

05、渗透型保护剂的配置

冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

无血清细胞冻存液如Corning KM Banker II，属于即用型细胞液可直接冻存于-80℃冰箱而无需程序性降温。无血清细胞冻存液不含血清，只含DMSO、葡萄糖等营养成份，大大降低了动物血清来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险，且冻存液成分和配比明确，批次间差异很小，能够保证生长细胞状态的稳定性，细胞存活率高。

如何冻存细胞

一、材料

（明模岁一）仪器

1.

净化工作台

2.

离心机

3.

恒温水浴箱

4.

冰箱（4℃、-20℃、-70℃）

5.

倒置相差显微镜

6.

培养箱

7.

液氮冰箱

（二）玻璃器皿

1.

吸管（弯头、直头）

2.

培养瓶

3.

玻璃瓶（250ml、100ml）

4.

废液缸

（三）塑料器皿

1.

吸头

2.

枪头

3.

胶塞

4.

移液管（10ml）

5.

15ml离心管

6.

冻存管（1～2ml）

（四）其他物品

1.

微量加样枪

2.

红血球计数板

3.

记号笔

4.

医用橡皮膏

5.

移液枪

（五）试剂

1.

D-Hanks液

2.

小牛血清

3.

培养液

4.

双抗（青霉素、链霉素）

5.

胰蛋白酶（0.08%）

6.

1NHCl

7.

7.4%NaHCO3

8.

DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油

二、操作步骤

（一）细胞冻存

1.

配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2.

取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶激睁把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；

3.

离心1000rpm，5min；

4.

去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

5.

将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5

ml；

6.

在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

7.

冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/

min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/

min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h

，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二）

细胞复苏

1.

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2.

从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细码灶胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3.

离心，

1000rpm，5min；

4.

弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5.

次日更换一次培养液，继续培养。

三、注意事项

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

具体步骤：

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。

加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证枝悉姿温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要求：

1．无菌环境

无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。

3.适宜的渗透压

高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。

4．气体环境与pH

细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。

注意事项：

（1）第一次开始培养某种细胞时，一定要在WWW. ATCC. ORG上用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。

（2）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照步骤操作。

（3）预防细胞污染

（4）防止细胞交叉污染

扩展资料：

动物细胞培养：

在所有的细胞离体培养陆告中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。

⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最猛绝常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。

⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。

参考资料：细胞培养-百度百科

求细胞冻存液的主要作用及成分。越全越好。。

细胞冻存液的作用是将活细胞冻存后，长期保存。

一般配置冻存液有两种配方者租仔

1.

培养基，血清，首汪DMSO配比为7：2：型族1

2.

血清，DMSO配比为9：1

细胞冻存液怎么配

10%-15%（常见为10%）的DMSO或甘油，含10%-20%血清的冻存培养液。

一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提租判供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞。

有人亲测10%血清冻存细胞，结果证明是可以的，但高血清比例的冻存液更有助于提高细胞活力，此外娇贵的细胞可以适当提高冻存液中血清的比例以保证获得更高的存活率及活力。

扩展资料

细胞冻存和复苏的原则：

慢冻速融，这样坦举更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。

常用的冻存保护剂为二甲基亚砜（DMSO）和甘油，冻存细胞时加入保护剂，一方面可以提高细胞膜对水的通透性，另一方面使冰点降低，延缓冻结过程。

缓慢冻存细胞的过程中，加入保护剂可以使让型碧细胞内水分渗出到细胞外，一定程度上减少胞内冰晶的产生，而在快速复苏细胞的过程中，能使胞外冰晶迅速融化，防止水分渗入胞内再次形成冰晶而损伤细胞。

参考资料来源：百度百科-细胞冻存

细胞冻存的操作步骤

细胞冻存

1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清,4℃冰箱保存预冷；

2.用胰酶对细胞进行消化渣悄返：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基,PBS冲洗两次,用胰酶消化细胞（尽可能温和）；

3.再次用完全培养液悬浮细胞,将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中,用滴管轻轻吹打混匀.

4.在每支冻存管中加入1ml细胞液,密封后标记冻如饥存细胞名称和冻存日期.

5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力,如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜,放入液氮罐）最好；或者可以在4℃,2h；然后转到-20℃,2h；-80℃运谈,2h；放入液氮罐.

这是我实验中用的protocol,