外泌体的鉴定要做几次?（外泌体提取鉴定）

本文目录一览：

• 1、细胞外泌体是什么？
• 2、外泌体是做什么的？
• 3、外泌体一般做几次效果最好？
• 4、什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？
• 5、外泌体还可以这样研究吗

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

外泌体是做什么的？

外泌体（Exosomes）是一种双磷脂膜囊泡，含有蛋白、脂质及核酸等多种成分，是细胞外囊泡的一种。外泌体体积小，直径在40～200 nm,在透射电镜下具有典型的杯状结构。几乎所有的细胞都分泌外泌体，外泌体在细胞间的连接中发挥重要作用。

01、外泌体的形成

细胞发生内吞后，内陷的细胞膜形成数个小囊泡，小囊泡相互融合形成了早期内体（early endosome），逐渐成熟的早期内体膜多处凹陷并向内出芽形成含管腔状囊泡（intraluminal vesicle,ILVs）的晚期内体（late endosome）；富含ILVs的内体称为多囊体（multivesicular body,MVBs）。MVBs有两个去向：一部分MVBs与溶酶体融合，以降解其内容物；另一部分MVBs与细胞膜融合，释放ILVs到细胞外，这些分泌的ILVs即为外泌体。

02、外泌体的功能

外泌体是一种细胞连接物，能够输送蛋白、脂质及核酸到靶细胞，可以在血管形成、抗原呈递、炎症反应和细胞增殖及分化等各种生物过程中发挥功能。

外泌体可以通过两种途径影响受体细胞，其一，外泌体和受体细胞间的配体-受体相互作用，无需将外泌体或其内容物内化到靶细胞。其二，外泌体通过膜融合或内吞作用进入细胞，其成分被摄取后释放到细胞质中，通过调节特定的基因表达和信号通路影响宿主细胞，最终导致细胞功能或表型的改变。

外泌体一般做几次效果最好？

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外泌体

不知道你有没有这样的经历，就是涂了非常多的粉底液却总是盖不住脸上的疲惫感？抹了再多的遮瑕也挡不住乌青的眼圈？而且用再多的高光和提亮等也藏不住深深的泪沟？其实小编说句心里话，现在的各种化妆产品往往只能起到锦上添花效果，就算你可以把脸上的小痘印、小雀斑遮挡住，但是皱纹和松弛的皮肤状态却是很难遮挡得住的，今天小编就给女神们推荐一个抗衰神器-外泌体。

首先外泌体是什么？

外泌体无疑是眼下生物科学领域最炙手可热的研究对象，它仅仅在几十年时间里就就在“囊泡运输”研究领域拿下了4次的诺贝尔生理学或医学奖，可以说得上是名副其实的“诺奖实力派”，在2013年的时候诺贝尔就授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼和德国科学家托马斯·祖德霍夫生理医学奖，以此来表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制。

外泌体

其实外泌体就好像是一位快递员，它主要是负责细胞之间的物质运输和信息传递，它从细胞阶段抗衰，传递运输营养或某种活性物质，发送抑制信号让炎症因子“闭麦”；其中发送促进信号可以加快细胞再生和胶原合成等让皮肤健康焕新。严格意义上来讲外秘体就是细胞的囊泡，它可以分泌出很多种细胞因子和大量的胶原因子，通常它的直径会在30-100纳米，简单来讲就是头发的千分之一，它可以自由的进入细胞的间隙（从表皮到真皮），外泌体作为细胞美容的升级版，它不仅克服了细胞的局限性，而且又可以设定明显的靶向性，为皮肤组织修复与改善开辟了新角度。

外泌体对我们皮肤有什么用？

我们都知道所有的皮肤问题最终都会归结到细胞上，就拿皮肤的细胞来说：如果一个人的皮肤细胞出现了问题，那么会很容易出现这几种情况，首先是炎症问题会使细胞间的通讯中断，接着导致皮肤的自我调节功能没有办法进行正常工作；还有就是细胞受损使得细胞的新陈代谢出现问题，如果细胞生命周期变短了，那么细胞分裂更新速度变得非常缓慢，最后随着人的年龄增长胞也会慢慢的“集体衰老”，而衰老细胞会逐渐的累积起来，进而出现肌肤暗黄干燥、长皱纹等问题。

外泌体对我们皮肤有什么用？

能够直接调控细胞的外泌体就无疑是像拿到了影响细胞的关键钥匙，它会像一个小精灵一样利用细胞记忆去智能调控肌肤修复方向，并且激活自体细胞再生力和加强新陈代谢能力。

为什么抗衰需要外泌体

我们来举个例子：像一些皮肤比较薄的人是很容易出现干燥、敏感等问题，这主要是因为皮肤层次太薄、细胞缺失、胶原蛋白层缺失等问题导致的，而整个皮肤衰老的原因一般都会归于基因变异、细胞衰老、细胞损伤增加和端粒异常等因素。

为什么抗衰需要外泌体

而外泌体是有多种的细胞因子组成的细胞结构，它主要是修复细胞层面的再生，接着由新生的细胞重组你衰老的细胞，最后激活细胞能量。话句话说就是我们皮肤出现问题，在很多时候是根源性皮肤细胞因子排序错乱或缺失、衰老即萎缩等所导致的，那么它就需要完整的细胞因子帮助修复你受损等的细胞，而光泽、水嫩、代谢加速实际上都是因为新生细胞重焕活了新生肌肤，最后让皮肤就会走向年轻化趋势。

什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？

外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。

目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。

由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。

外泌体还可以这样研究吗

外泌体的提取主要包括以下几种方式。

一是超速离心法，这是目前外泌体提取最常用的方法 。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块， 由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种 方法得到的是微泡不是外泌体 。

二是过滤离心， 这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性 ，但同样存在纯度不足的问题。

三是密度梯度离心法， 用此种方法分离到 的外泌体纯度 高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。

四是免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态 的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH 和非 生理性盐浓度会影响外泌体生物活性， 不便进行下一步的实验 。

五是PS亲和法，该方法将PS（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。2016.9 nature杂志发表了该方法最新数据，表明PS法可提取相当高纯度的外泌体。

六是色谱法，这种方法分离到的外泌体在 电镜下大小均 一， 但是需要特殊的设备 ， 应用不广泛 。