外泌体含量测定（外泌体含量测定多少钱）

本文目录一览：

• 1、如何判别真假外泌体？
• 2、New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles
• 3、细胞外泌体是什么？
• 4、实战分享 | 外泌体提取之经验小结
• 5、外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论
• 6、什么是外泌体？

如何判别真假外泌体？

外泌体，被称为抗衰界扛把子，近两年也是非常火啊，其实对于我们消费者而言如何去判别真假外泌体，主要就去看外泌体的研发企业资质与技术是否达标就可以了，外泌体因其属于生物技术，所以对于企业资质及研发技术要求极高，非cGMP实验室无法达到提炼外泌体的标准，市场上的我比较推荐奥本源的外泌体美容疗法。还有最重要的要看是不是冷冻的，不是冷冻的基本上都不是，因为常温下外泌体都失活了；第二就是看活性含量，那些活性含量很低的可能便宜，但是基本上效果是没有的，还是要擦亮眼睛；在形式上，原液的优于冻干粉的，因为冻干粉也容易让外泌体丧失活性。百度这方面的资料很多。

New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles

原文链接： Huilin Shao, Hyungsoon Im, Cesar M. Castro, Xandra Breakefield, Ralph Weissleder and Hakho Lee. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles. Chem Rev. 2018 Feb 28;118(4):1917-1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534.

该综述发表在Chemical Reviews杂志上，影响因子高达54.301分，对细胞外囊泡的研究方法总结非常全面，基本上目前EVs研究中用到的研究方法，这篇综述都有介绍，十分详尽！通讯作者是哈佛大学的Hakho Lee教授。

Extracellular Vesicles (EVs) 细胞外囊泡是由细胞主动释放的多样的纳米级膜囊泡。类似大小的囊泡可根据其生物发生、大小和生物物理性质进一步分类(如外泌体、微囊泡)。虽然EVs最初被认为是细胞碎片，因此未被重视，但现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信和疾病诊断和预后的循环生物标志物的重要载体。

该综述的内容包含：

生物流体（Biofluids）中含有大量的EVs，这些EVs可以从Parental Cells转移不同的分子去其他细胞，包括：蛋白，mRNA/miRNA，DNA等。

EV的形成决定了其膜组成。

微小囊泡的膜组成最能反映其Parental Cells(母细胞)的质膜。

相反，外泌体中已经鉴定出特异性的内体蛋白分子，这反映出外泌体形成的机制。内体分选复合物（ESCRT）已被广泛认为用于调节和引导特定分子进入MVB的腔内囊泡。ESCRT及其四个主要复合物（ESCRT 0，I，II和III）负责传递泛素化蛋白，用于溶酶体降解和蛋白回收。最近的研究表明，特定的ESCRT家族蛋白的耗竭可以改变外泌体的蛋白质含量和细胞释放外泌体的速率。更有趣的是，发现外泌体富含ESCRT系统的成分（例如TSG101和Alix），可用作外泌体识别的标记。

ESCRT不是介导外泌体形成的唯一机制。其他不依赖ESCRT的过程似乎也能以相互交织的方式参与其形成和分泌。外泌体也富含ESCRT非依赖性的分子。例如，四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81已被证明参与内体小泡运输。小GTP酶的Rab家族参与小泡运输和与质膜融合表明这些蛋白在释放外泌体中的作用。另外，外泌体中神经酰胺水平升高，抑制鞘磷脂会引起的外泌体释放减少，表明鞘磷脂酶与囊泡释放有关。

外泌体和微囊泡都包含核酸，包括miRNA，mRNA，DNA和其他非编码RNA。自从最初发现EV含有RNA，人们一直非常关注EV RNA用作诊断生物标志物。在开创性的工作中，Skog等人发现胶质母细胞瘤患者的血清外泌体含有特征性的突变mRNA（EGFRvIII mRNA）和miRNA，可用于提供诊断信息。这些核酸的发现导致了这样的假设，即EVs可以在细胞之间转移遗传信息。确实，瓦拉迪等人和Skog等表明，EV含有转移进入宿主细胞后仍然可以翻译的mRNA。EV中也有逆转座子和其他非编码RNA的表达。逆转录转座子序列和miRNA以及可翻译的mRNA都通过EV进行转移，这些成果突出了EVs作为遗传信息的载体和传播者的重要性。

虽然传统的光学显微镜的衍射极限接近EV的大小，但是不能产生清晰的图像。高分辨率EV图像需要通过电子显微镜(EM)或原子力显微镜(AFM)得到。然而，这些方法的通量有限，因为需要专门的染色方案和设备。

（a）扫描电子显微镜（SEM）提供三维的表面拓扑信息。

（b）透射电子显微镜（TEM）具有出色的图像分辨率，可结合免疫金标记一起使用来提供分子表征。

（c）冷冻电镜（cryo-EM）无需大量处理即可分析EV形态。

动态光散射 (DLS)，也称作 光子相关光谱 或 准弹性光散射 ，是一种物理表征手段，用来测量 溶液 或 悬浮液 中的 粒径分布 ，也可以用来测量如高分子浓溶液等复杂 流体 的行为。当光射到远小于其波长的小颗粒上时，光会向各方向散射（ 瑞利散射 ）。如果光源是 激光 ，在某一方向上，我们可以观察到散射光的强度随时间而波动，这是因为溶液中的微小颗粒在做 布朗运动 ，且每个发生散射的颗粒之间的距离一直随时间变化。来自不同颗粒的散射光因相位不同产生建设性或破坏性干涉。所得到的强度随时间波动的曲线带有引起散射的颗粒随时间移动的资讯。动态光散射实验易受灰尘或杂质影响，故样品的 过滤 和 离心 十分重要。

动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。

动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。 小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。

在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但是动态光散射技术由于是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。

纳米粒子跟踪分析(NTA) 是一种光学粒子跟踪方法，用于确定粒子的浓度和大小分布。用光束照射样品中的粒子。当粒子散射光并经历布朗运动时，摄像机记录下每个粒子的路径以确定平均速度和扩散率。与DLS的体散射测量不同，NTA跟踪单个粒子的散射。

然后，此信息将用于数学计算浓度（即视野中的粒子数量）和尺寸分布（即通过Strokes-Einstein方程的流体动力学直径，图5b）。 为了准确定量异质囊泡的浓度和大小，NTA程序需要精确优化摄像头和分析设置。 可能需要使用不同设置进行单独测量，以获取异质混合物中EV子集的准确读数。

EVs在大小、起源和分子组成上都是异质性的；除此之外，它们还存在于不同的复杂的生物流体中，包括血、胸腔积液、腹水、乳汁、唾液、脑脊液和尿液。这些流体中还含有大量的非囊泡大分子结构，可能会干扰EV的分析。所以EV的分离和富集显得尤为重要。

超速离心法（80%）和密度梯度离心法（20%）是最常见的两种高通量混合分离法。根据它们分离机制，这些方法可以分为三大类:密度、亲和和大小。

用不同的离心力将颗粒分离:以较低的离心力(300g)去除细胞碎片，而以较高的离心力(100000g)对EV进行沉淀和浓缩。尽管该方法是应用最广泛的金标准，但它也有许多缺点，如体积大、仪器昂贵、处理时间长、过程繁琐、被聚集的蛋白质和核蛋白颗粒污染以及需要大量的样品。

蔗糖梯度离心法是一种更为严格的超速离心法，它有助于进一步分离不同密度的囊泡，通常用于分离外泌体(悬浮密度为1.15至1.19 g/mL)。在这种方法中，一个包含不同大小囊泡和大分子的样品在一个密度从上到下递增的梯度表面上被分层。在离心过程中，不同的分子以不同的速率通过梯度沉积。由于其分辨率更高，该方法被认为可以分离更高纯度的EVs(特别是外泌体)；然而，它面临着许多与超速离心法相关的限制。更加新的等渗梯度(如碘黄醇梯度)法被认为效果更好。

最近，基于聚合物共沉淀法的商业试剂盒(例如，ExoQuick, Exo-Spin)已被开发用于EV富集。这些试剂采用降低EV的水合作用(从而降低溶解度)导致沉淀，然后在低离心力的情况下，沉淀的EV产物可以很容易地、重复性地分离出来，从而避免了长时间的超速离心法操作。然而，这些试剂盒对于大规模使用来说是昂贵的，而且对于EV来说缺乏特异性。该方法还容易产生非均相聚合物颗粒。由于这些试剂均降低了EV和蛋白质的溶解度，因此该方法还可共沉淀脂蛋白和Ago-2 RNA复合物。因此，共沉淀法作为EV分离方法受到了限制。

大小排阻色谱法根据它们的分子大小通过凝胶过滤来分离囊泡和其他分子。这种凝胶由含有特定大小分布孔隙的球形珠组成。当样品进入凝胶时，小分子扩散到孔隙中，而大分子则直接洗脱。因此，大分子比小分子更早地离开色谱柱，这使得分子的停留时间与色谱柱的大小相关联成为可能。近年来，该分离方法已被应用于从复杂的生物媒介中分离纯化囊泡。Sepharose, GE Healthcare; qEV, iZon等商业公司也正在开发商业的产品以简化EV富集，这些产品的排除柱都大约是75纳米孔径的树脂。蛋白质和其他较小的污染分子被滞留在孔径中，而较大的囊泡(75 nm)可以迅速通过并在空隙中被洗脱。大小排阻法可将EV与可溶性蛋白分离；为提高分离的效率和分辨率，需要考虑多种因素，包括介质类型、孔径、EV与介质之间的相互作用、柱的尺寸、柱的填充以及流速等。

为了提高复杂生物流体的EV分离效率和特异性，人们开发了多种新的EV富集方法。然而，与传统方法相比，这些新方法中的大多数具有较低的吞吐率，应加以解决使之变得实用。

基于分子大小的分离是一种很有潜力的方法，可以将EV与大型细胞碎片分离开来。各种微流体过滤系统已经被开发出来，用于从大的细胞碎片和蛋白质聚集物中分离EV，这些系统大部分是基于分子大小差异。例如,Rho等人构建了一种微流控设备，该设备使用膜过滤器对未处理的血液样本进行筛选，来分离EV。膜过滤器的大小∼1μm。在膜的下方插入一个毛细管，用于引导过滤后的EV进入收集通道。膜过滤器和毛细管导向器夹在两个环形磁铁之间；这种设置在进行大量的样品处理时可以方便地更换过滤器集。

Lee等人最近使用声波以无接触方式对EV进行细分。这种分离利用超声波驻波，根据囊泡的大小和密度对其施加不同的声交互作用力。该装置由一对相互交错的换能器(IDT)电极组成，用以产生跨流动通道的驻波表面声波。

EV蛋白主要来源于胞质膜、胞质醇，而非其他胞内细胞器(如高尔基体、内质网、细胞核等)。EV蛋白质的构成提示了囊泡的生物发生和cargo sorting(这个翻译有点怪)。因此国际细胞外囊泡组织建议应该仔细鉴定EV蛋白，特别是跨膜蛋白和胞质蛋白。

在哺乳动物中，跨膜蛋白和脂质结合的细胞外蛋白(如内贴蛋白)都与微囊泡和外泌体有关。外泌体的跨膜蛋白富含四聚体蛋白(如CD9、CD63和CD81)一个具有四个跨膜结构域的蛋白质超家族。四聚体蛋白参与细胞膜的转运和生物合成的成熟，在外泌体中高表达，这一特性使得四聚体蛋白被用于外泌体的定量和表征。然而，需要注意的是，四聚体蛋白并不只在外泌体中唯一表达。另一方面，微囊泡富含整合素、选择素和CD40配体，表明它们来自于细胞的质膜，EV富含特异的跨膜蛋白受体(如表皮生长因子受体/ EGFRs)和黏附蛋白(如上皮细胞黏附分子/EpCAM)。由于许多跨膜蛋白参与了正常生理和疾病的发病机制，它们被用作重要的病理生理学EV生物标志物。

EV相关的囊内蛋白具有多种功能。它们包括具有膜或受体结合能力的参与囊泡运输的胞质蛋白，如TSG101、ALIX、annexin和Rabs。EV还富含细胞骨架蛋白(如:内酯、肌凝蛋白和小管蛋白)、分子伴侣蛋白(如:热休克蛋白/HSPs)、代谢酶(如:烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶/GAPDH和核糖体蛋白)。有趣的是，最近的研究发现EV蛋白可以被受体细胞有效地运输和接收，从而在体内和体外引起强烈的细胞反应。这带来了EV作为治疗和药物载体的新机遇。

EV蛋白的定量和特征鉴定不仅对阐明EV的生物发生和cargo sorting有重要意义，而且对鉴别生理和病理标志物也有重要意义。然而，传统的蛋白质分析，包括Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)，通常需要大样本量、大量处理和/或庞大的专门仪器，因而不太适合临床应用。

在EV蛋白评估时，Western blotting可能是最常用的技术，用于提示与EV相关的靶蛋白的存在。在这个过程中，纯化的囊泡制剂(通常通过现行的梯度超离心法金标准制备)可以用含有变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲裂解液进行处理。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS−PAGE)分离蛋白裂解物，然后转移到膜上，对特定的蛋白target进行免疫印迹。虽然这种方法有很长的准备和处理时间( 10h)，但是Western blotting可以提供关于蛋白质分子大小的有用信息。

不像Western blotting，ELISA只能在相对较小的范围内对目标蛋白进行定量，质谱分析可实现高通量肽谱分析。纯化的EV制剂经过酶消化和肽分离，然后用质谱仪电离分析。在这个复杂的过程中，多个步骤严重影响EV蛋白组学分析。除了有效的EV纯化，质谱分析之前的肽分馏被认为是鉴定囊泡蛋白的一个重要前提。通常通过三种主要方法实现：(1)SDS−PAGE，(2)二维液相色谱和(3)基于等电聚焦的分馏。

值得注意的是，既然质谱分析可以鉴定消化后的肽片段，那么适当的蛋白质鉴定、定量和验证是必要的。已经有两种用于定量的技术方法：基于标签的和无标签的。在基于标签的定量分析中，标签(等压或同位素)被用于比较分析。无标签的定量分析中，色谱强度的谱计数被应用。识别出的候选蛋白可以使用其他传统的蛋白质技术如Western blotting进行验证。在检测灵敏度方面，质谱法通常不如基于抗体的技术敏感。

虽然质谱分析需要大量的准备和处理时间(数天)，但它可以提供高通量、定量和EV比较蛋白质组分析。到目前为止，已有成千上万的囊泡蛋白被系统分类，蛋白质-蛋白质相互作用分析。基于质谱的哺乳动物和细菌EV的蛋白质组学分析的详细讨论已经在一些综述中被强调。这些网络和相互作用的研究有助于阐明EV载体的功能活动及其在细胞间远距离通信中的重要作用。

为了解决EV蛋白质定量相关的技术挑战，新一代生物传感器正在开发中。与传统的蛋白质检测方法相比，这些生物传感器利用独特的传感机制，可以检测各种大小和分子含量的EV。这些技术中的许多只需要更小的样本量和更少的样本处理过程，因此非常适合于医疗应用。

流式细胞术是一种基于光散射和荧光激活来分选单个大颗粒(如细胞或微米大小的实体)的强大的技术，然而，传统的流式细胞术对检测直径小于500 nm的小颗粒的灵敏度和分辨率有限。此外，它还受到高光学背景的影响，由于鞘层流体中存在小颗粒(约200 nm)。用传统流式细胞术量化EV时，大量的小EV可能被忽略或者计数偏低：可能同时有多个小的囊泡被照亮被计数成一个单独的事件，这种现象被称为“群体理论”。

为了解决传统流式细胞术的弊端，微米大小的乳胶珠被用来绑定多个囊泡。然后用荧光抗体对结合的EV进行染色，并对其蛋白标记物进行鉴定。然而，这种方法缺乏分析单个囊泡的能力，并且不能区分不同的囊泡亚群，这可能会导致特征的丢失。

该技术主要基于磁性纳米粒子(MNPs)。由于大多数生物物质天然缺乏铁磁背景，这种传感几乎不受同系统中其他生物样品的干扰。因此，即使光学上浑浊的样品对磁场也是透明的；当靶分子被特定的MNPs靶向时，它们与自然的生物背景形成了强烈的对比。在基于核磁共振(NMR)的磁检测中，MNPs置于NMR磁场中，产生局部磁场，改变周围水分子的横向弛豫率，放大分析信号。因此，核磁共振减少了样本处理过程，提高了检测灵敏度，已经被开发用于多个医疗点应用(例如，直接从血液样本中检测循环肿瘤细胞和细菌)。

但是将这种技术运用在EV检测上却遇到了挑战，因为EV明显比肿瘤细胞小1到2个数量级。Shao等人开发了一种专门用于EV检测和蛋白质分析的新分析技术。此方法采用两步生物正交点击化学方法来标记EV，这种小分子(200 Da)标记策略并没有显著增加抗体或MNP的大小，从而提高了从非结合抗体和MNPs中保留目标囊泡的效率。使用微流控芯片上微核磁共振(μNMR)直接测量EV来确定EV生物标志物的丰度。

相比传统的蛋白技术，μNMR系统表现出更好的检测灵敏度：比WB和ELASA灵敏10 3 倍。Shao等人利用这种集成技术可研究在培养皿中生长的多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系中的EV。比较蛋白分析证实，EV确实反映了其亲代细胞的蛋白概况，组合GBM的四种标志物(EGFR、EGFRvIII、PDPN和IDH1)

R132H)可用于区分癌症来源的EVs与宿主细胞来源的EVs。

鉴于EV的尺寸小，一种新的快速无标签EVs检测方案：表面等离子体共振(SPR)被提出。SPR是指在入射光照射下，金属介电界面上传导电子的集体振荡。不同于其他基于时敏荧光和化学发光探针的光学检测方法，SPR传感检测金属-介电介面附近生物分子结合相关的局部折射率变化，应用于无标签和实时检测。

RNA是EV携带的主要核酸。与细胞中的RNA相比，eEV运输的RNA通常更短(通常200个核苷酸，但也有长达5 kb的)。它们主要是非编码rna，包括microRNA(miRNA)、tRNA (tRNA)、长链非编码RNA (lnRNA)和片段化的mRNA。编码mRNA (mRNA)已在长度为200~1000个核苷酸的转录组中被识别。mRNA可以翻译成蛋白质，而miRNA可以调节受体细胞中靶mRNA的翻译。EV中RNA的数量和性质可以根据其来源的细胞类型而变化。

由于它们在受体细胞中保留了功能，研究人员提出了有趣的假设，即可能存在专门的机制将不同的RNA分配给EV运输到特定的受体细胞，或可能利用这些机制运送治疗性RNA到特定的部位。这是一个活跃的研究领域，已经有一些综述对其进行阐述。

近年来的研究发现，EV中含有相当比例的母细胞的mRNA，其中许多是细胞特异性的mRNA。这些mRNA分子通常以片段的形式存在于EV中，保护其不被RNA酶降解，使它们成为强有力的循环生物标志物。

此外，已在多个研究中得到证实：EV中一些2 kb的mRNA分子能够编码支持蛋白质合成的多肽(即，蛋白质翻译的功能)。这些研究强调了EV作为特定的细胞信使在影响受体细胞和促进细胞间通讯等多方面的作用。

miRNA是一类小的非编码rna(一般为17 - 24个核苷酸)，通常通过靶向mRNA的3’非翻译区介导转录后基因沉默。通过抑制蛋白质的翻译，EV miRNAs在许多生物过程中都是强有力的调控因子。不同于EV中的循环mRNA，miRNA可以以多种稳定形式存在于体液中。除了被包裹在EV中，循环miRNA还可以被加载到高密度脂蛋白或结合到囊泡外的AGO2蛋白上。目前的证据表明，虽然大多数循环miRNA都与RNA结合蛋白相结合，但在EV中也能发现少量的miRNA。然而，miRNAs在EV中的分布仍不清楚。与mRNA的情况一样，EVs中的miRNA表达反映了其细胞来源，但与亲代细胞略有不同。一些miRNA已被发现优先表达在EV中，并在受体细胞中保持功能以调节蛋白翻译。最近的研究还发现，在哺乳动物细胞培养中常用的胎牛血清可能在体外EV制备过程中导致miRNA伪影。

通过NGS，我们还发现有其他类型的RNA存在EV中。这些RNA包括tRNA，rRNA，小核RNA(snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)以及长链非编码RNA (lncRNA)。参见上表。

最近的研究表明某些EV可能含有DNA片段。这些DNA是双链片段，范围从100个碱基对(bp)到2.5 k bp，EV外部还有一些与之相关的2.5k bp的DNA片段。这些片段代表整个基因组DNA，可用于鉴定亲代肿瘤细胞中存在的突变。虽然有可信的证据表明在EV中存在DNA，但其功能尚未确定。

EV核酸作为一种潜在的循环生物标志物和受体细胞间的调节因子已被广泛研究。传统的核酸提取和分析工具已经成功地为我们理解EV核酸奠定了重要的基础。由于EVs中核酸的含量较低，开发高效的提取方法和灵敏的检测策略是非常重要的，特别是在小样本中对稀有目标分子进行检测。

随着人们对利用EV核酸作为微创诊断标记的兴趣日益浓厚，新的生物传感器技术已被开发出来，使提取和分析变得更加高效、快速。这些新平台中有许多提供了对目标核酸标记的敏感定量，并且能够在复杂的生物学背景下识别疾病标记，甚至包括单核苷酸点突变。这为个性化临床医疗开辟了许多新的机会。

虽然传统PCR是检测基因/转录突变的强大技术(例如，EGFRvIII缺失突变)，但其敏感性有限，其在检测单核苷酸突变方面存在很多不足。这个问题与EVs特别相关，因为在野生型转录本的大背景中，突变转录本的比例很低。Chen等人最近采用了一种液滴数字PCR (ddPCR)技术来检测EV中的罕见突变。

Shao等人最近开发了一种综合微流控平台，用于现场EV核酸分析，该平台集成了三个功能模块：靶向富集EVs，芯片上RNA分离，实时RNA分析。这个平台被称为免疫磁性外泌体RNA(iMER)分析平台：利用抗体功能化的磁珠从宿主来源的囊泡中分离癌症特异性EVs，然后在芯片上裂解免疫磁珠吸附的囊泡。当EV裂解液通过玻璃珠过滤器时，选择性吸附EV RNA并从过滤器中洗脱，用于反转录和qPCR分析。为了简化分析过程，所有关键部件都集成到一个芯片盒中。

随着该系统的发展，作者研究了核蛋白的两个mRNA靶标，MGMT(6-甲基鸟嘌呤)

肿瘤是一种复杂的结构，包括恶性细胞和周围的基质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。最近的研究表明，EVs在肿瘤微环境中促进细胞间通讯，从而调节疾病的发生、发展，并且在治疗反应方面发挥重要作用。

这一大块儿的其他内容大家感兴趣的话可以阅读原文献。

在大多数神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆)中存在类似的疾病进展模型，其中错误折叠的蛋白质自结合形成有序的聚合体并在细胞中聚集。阿尔茨海默病(AD)中，淀粉样蛋白的Abeta肽的形成可能是这些蛋白聚合体中最著名的。帕金森疾病(PD)中，另一种类型的聚合体在细胞内形成，主要由alpha-synuclein(突触核蛋白)组成，称为路易小体。最近的研究表明，许多神经退行性疾病中涉及的错误折叠蛋白出现在EV中。因此，这些囊泡为检测和监测神经退行性疾病带来了新的希望。

AD是一种迟发性神经系统疾病：由于神经变性而导致记忆和认知能力的逐渐丧失。虽然AD的确切病因仍是一个有争议的话题，但很明显，与Aβ肽相关的斑块沉积和与tau蛋白相关的神经纤维缠结对疾病的进展是非常重要的。这些淀粉样肽来源于淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解过程。这一

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

实战分享 | 外泌体提取之经验小结

近些年来，关于外泌体的研究如火如荼。外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。 来自华中科技大学同济医学院附属协和医院的崔老师，对外泌体提取积累了自己的心得，并将自己的研究成果发表在 Bioactive Materials 上。 下文是崔老师的分享。

要进行关于外泌体的研究，提取纯化外泌体一直是大家非常关注的问题。 能否获得较高纯度的足量外泌体，直接关系着后续研究能否开展 。虽然目前仍然没有能同时保证外泌体的含量、纯度和生物活性的提取方法，但是我们可以结合当前的实际情况，对外泌体提取做一些探讨和经验总结。

超速离心（差速离心）法是目前最常用的外泌体提取方法 ，即采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎。本人近期发表的论文中最后也是采用了这种方法。

具体的步骤大家都比较熟悉，无论是提取血清来源的外泌体，还是细胞条件培养基来源的外泌体 ，大家都习惯于先将血清或者条件培养基收集后保存于-80℃的温度下，等达到一定量后，再批量进行超速离心。

这样的话， 大家会发现一个非常严重的问题，尤其是在拍摄电镜的时候——背景杂质很多，并且很多囊泡的形态不够典型，不是文献中描述的那种典型的双凹圆盘状或者茶托状。

通过几次实验的对比，我大概发现了原因， 主要是由于在冻存收集到培养基的时候，没有进行低速离心和普通高速离心。

低速离心可以去除培养基中的未贴壁细胞、死细胞以及大的细胞残骸，而普通高速离心可以去除其中的大型细胞外囊泡。无论是未贴壁细胞、死细胞、大的细胞残骸，还是大型细胞外囊泡，在-80℃冻存及复温的过程中，都会发生破裂，产生小型的细胞膜碎片结构。

这样的话，就导致了电镜背景很杂乱，难以达到高水平论文杂志期刊的要求。另外，还会导致这样一个矛盾现象，即蛋白定量中计算的外泌体产量虚高，而蛋白免疫印迹中外泌体标记物蛋白的含量却不高。

因此，在这里推荐给大家一个小贴士

就是在收集准备提取外泌体的条件培养基或者血清时，一定要提前做到低速离心和普通高速离心这一步，尤其是为了做透射电镜或者蛋白免疫印迹实验而提取的外泌体 ，一定要注意这一点。尽管过程比较费时，但是能生产出有用的结果才是更重要的。

至于其他的外泌体提取方法，如密度梯度离心、色谱柱、超滤离心法、微流控芯片法、磁珠免疫法、多聚物沉淀法，我看到学校里面鲜少有人去尝试，毕竟更麻烦。但不同的方法各有优劣，大家可根据自己的实验，谨慎选用。

外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论

外泌体和微囊泡是几乎所有类型的细胞都能释放的细胞外囊泡(ev)的两大类，在生物液体中非常丰富，ev的分子组成和释放都被认为是受到外界刺激的严格调控的。多项研究一致表明，ev可以在不同的细胞类型之间转移蛋白质、脂质和RNA，从而介导细胞间的通信和信号转导。重要的是，ev中的小非编码rna被认为是在受体细胞中发生的分子事件的主要贡献者。

此外，外泌体和微囊泡中的RNA可以作为多种疾病的非侵入性的生物标志物，包括免疫系统的病理变化。

这篇综述旨在提供ev相关RNA转录组领域的最新技术，以及对以往使NGS测序来描述不同细胞释放的ev中RNA含量的研究进行全面分析。最后，我们强调了与获得纯EV和 EV相关RNA的深度测序 相关的技术挑战。

细胞外囊泡分为三种类型（ classifified by their origin and biogenesis）：apoptotic bodies (ABs), microvesicles (MVs, also known as shedding vesicles), and exosomes。

大肿瘤小体(LOs)已被确定为第四种类型的ev，它是由肿瘤细胞脱落的膜泡产生的，其大小与 ABs相似。

它们直径大小不一，包含物也有所差异：MVs和外泌体包含各种细胞质和膜解蛋白以及脂质、糖和核酸（9），而ABs可能还包括核组分和细胞器。

marker特征差异：外泌体特征良好的蛋白标记物包括各种四酯蛋白，如CD9、CD63和CD81；而mv包含质膜常见的跨膜蛋白，如整合素和选择素；同时，ab可以通过组蛋白的存在来区分。

在多种早期RT-qPCR技术以及最近的报道中，外泌体和MV中的mRNA、miRNAs和lncRNAs得到了一致的证实。更先进的高通量RNA测序方法的应用揭示了，从生物液体和细胞条件培养基中分离的ev亚群中存在各种其他RNA种类。

这些RNA种类包括snRNA、snoRNA、piRNA、vault RNA、Y-RNA、scRNA、SRP-RNA和7SK-RNA；以及来自rRNA、tRNA、mRNA、lncRNA和各种基因间重复序列的短片段。

TABLE 1 | 使用高通量测序显示EV转录组含量的报告

Nolte-‘tHoen等人通过高通量测序研究了培养过程中免疫细胞释放的EV中的小RNA含量。从EV中分离出的总RNA大部分是小RNA (200 nt)，含有少量的18S和28SrRNA。这些短RNA片段主要定位于蛋白质编码区和基因组重复序列，包括SINE、LINE和LTR序列。相反，细胞小RNA群体中存在的大部分序列代表miRNAs，而细胞分泌的EV中miRNAs的比例显著较低。

除了编码mRNA和重复序列的蛋白质外，EV组分还包含所有类型的结构RNA(如vaultRNA、Y-RNA、snRNA、snoRNA、SRP-RNA和tRNA)以及来自lncRNA和假基因的片段。

此外，相对于细胞RNA来说，许多小非编码转录本在EVs中富集，这表明细胞可能选择特定RNA进行细胞外释放。

许多其他研究也证实，由各种培养细胞释放的外泌体中，miRNA 的表达明显低于其他种类的 RNA，这些数据与先前的观察结果一致，即大多数个体外泌体不携带任何生物学上有意义的 miRNA 拷贝。然而，其他的 RNA 测序实验表明，一些细胞系释放的外泌体中相当大比例的小 RNA-seq reads仍然与 miRNA 相对应。

有趣的是，几个独立的小组观察到有15-50% total reads RNA 片段比对到包括逆转录病毒序列，LTR，SINE，和 LINE 序列的基因组重复序列。需要指出的是，作者并没有明确说明在上述研究中使用的小 RNA 文库制备方案是否包括允许捕获5′-OH 和/或3′-磷酸化 RNA 的修饰。因此，目前尚不清楚他们是否真的在相应ev中表征了小RNA的全谱特征。

Jenjaroenpun 等人和 Miranda 等人分别报道了在 MDA-MB 细胞培养液和尿液 EVs 中总 rna (包括长 rna 和小 rna)的测序，并显示了相当比例的 rRNA 读数(87-97%) ，与细胞质中的 rRNA 含量相似。在剩下的3-13% 的片段中，大约一半被标记为蛋白质编码转录本，另一半则标记为非编码 rna 和基因组重复序列。

在Beradrocco等人的另一篇报道中，作者分别使用total RNA和sRNA测序protocols来表征四种不同肝癌细胞系释放的EV中封装的长RNA谱。总RNA片段比对到rRNA的比例最大(32-66%)，而基因组重复序列的比例为15-44%，只有11 -25%的片段映射到蛋白编码和非编码RNA基因。对相同EV制剂进行的sRNA测序显示，RNA类别的分布略有不同:rRNA(16-54%)、基因组重复序列(24-40%)和转录组(24-51%)。

在另一项与small RNA测序相平行的全转录组RNA-seq研究中，Lasser等人证实，人类mast和红白血病细胞系释放两个外泌体群体(通过密度梯度浮选分离为HD和LD组分。在HD和LD部分中，长和短RNA cargo明显缺乏相关性，这表明这两个部分的细胞外RNA与不同的通路相关。与LD外泌体相比，HD中mRNA转录本的reads比例更丰富(75 vs. 20%)，而非编码RNA的分布则相反(25 vs. 80%)。 在 short RNA libraries，HD部分富集成熟miRNA(23%)，而LD部分主要是tRNA(28%)和成熟miRNA(10%)。

另一项研究研究了黑色素瘤细胞在培养过程中释放的三种不同EV类型的RNA含量，并确定了一些非编码RNA在每个EV样本中富集。RNA图谱表明，在相对中等水平的sRNA水平的ABs和MV中存在显著的18S和28S rRNA峰。相比之下，外泌体主要包含小RNA，与ABs和mv相比rRNA更少。尽管EV亚群的miRNA装载量与外泌体略有不同，但大量的miRNA仅在外泌体中被检测到，而在ABs和MV中均不存在，这支持了外泌体富集特异RNA的概念。必须指出的是，与miRNA相比，其他ncRNA种类不仅显著丰富，而且选择性富集在黑素瘤细胞释放的不同EV亚型，这增加了研究细胞外囊泡RNA货物及其功能的复杂性。

到目前为止，只有少数报道对从人类生物液体中分离的EV中的小RNA货物进行了下一代测序。这些研究表明，从人血浆、唾液和尿液中分离出的外泌体含有相当比例的miRNA reads(35-76%)。

上述生物流体EV中其余的RNA种类包括rRNA、lncRNA、tRNA、mRNA、重复区域以及小的非编码RNA如piRNA、snRNA、snoRNA等。值得一提的是，与“几天”细胞条件培养基相比，从生物体液中分离出的外泌体可能含有大量的大蛋白聚集物，包括通常在细胞死亡时释放的装载mirna的AGO复合体。因此，在人类体液中检测到的miRNAs是否确实与ev相关仍有待验证。

有趣的是，对尿液外泌体纯化的总RNA进行深度测序发现，其转录本分布与Cheng等人(48)观察到的完全不同。具体来说，大部分(约87%)的RNA reads被映射到rRNA上，只有约8%的reads被映射到非编码RNA和DNA重复序列上，而剩下的约5%对应于蛋白质编码RNA。相反，Miranda等报道的图谱统计和reads分布与细胞条件培养基中外泌体的总RNA测序结果相似。

综上所述，从上述研究演变而来的集体证据(表1)认为，大多数细胞释放的EV确实携带大量的非编码转录本和蛋白质编码转录本，以及它们的部分，在研究细胞外RNA对受体细胞的影响时应该考虑这些。

EVs RNA载物含量的差异可能部分是因为:

什么是外泌体？

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。