基于外泌体液体活检（鲜活外泌体）

本文目录一览：

• 1、外泌体提取策略
• 2、唾液真的可以抗癌吗?
• 3、重磅！非因指南性综述引领液体活检蛋白组技术新风尚!
• 4、什么是液体活检，CTC, cfDNA, ctDNA ？？
• 5、NGS在肿瘤临床基因检测中的应用2

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。 

唾液真的可以抗癌吗?

假设文章所提内容是真实的。里面的内容主要是:1. 唾液能够杀死癌细胞。2. 唾液中的酶能够与致癌物反应,将致癌物转化成安全的物质。首先:“对人的唾液用 小白鼠 、 小兔子 作临床观察发现,普通人的口水,可以杀死百分之七、八十的 癌细胞 ,”这句话作为唾液能够杀死癌细胞的论据,很可疑。因为检查受试物抗癌活性的动物体内试验的终点很少用“杀死百分之多少的癌细胞”来进行统计。这是由于在动物体内,癌细胞是不断增长的。如果说残余癌细胞是原有的百分之二十,那么这个值是怎么来的呢?究竟应该用谁比谁?另外动物模型一般是依靠肿瘤体积变化来确定药效的。因为肿瘤细胞在实体肿瘤中的比例并不确定(有如成纤维细胞/血管管壁细胞等支持细胞,是正常组织),而且细胞大小并不确定,因此用瘤体积是无法准确换算成细胞数的。因此杀死了百分之多少的癌细胞并不是一个动物药效实验的标准数据分析方式。可以说无法测量这个值。我们抛开癌细胞,把它看成以讹传讹,只看20%, 治疗组肿瘤体积变化 除以初始肿瘤体积变化是一个常见指标,20%是药效非常好的数据(这已经离题很远了)。但是我们还要问:唾液是如何给药的?如果是口服,我无话可说(虽然有点恶心)如果是其他方式,常用的有,腹腔注射,皮下注射,尾静脉注射,瘤内注射等等,给药途径和吞口水就有巨大差异。在这种情况下,是不能说明吞口水有效的。对于另一个实验,致癌物多种多样,其作用机理也各不相同。以我目前的知识我无法判断唾液里的酶是否能够和其中某一些发生反应。但是很显然它不可能和所有的都发生反应。如果能够对亚硝酸盐、重金属、苯并芘等等完全不同的致癌物都反应的话,这个东西也太奇怪了吧?(或许异型的强酸唾液真的可以.)另外,致癌物是通过各种方式造成DNA突变来引发细胞癌变,并没有什么所谓的“细胞的变异原性”。 细胞的变异原性这个词仅见于本文和一些说烧焦的肉能致癌的文章,并没有在比较正式的研究文献中出现过。单单这个词,就可以看出作者的水平。 “假造的专业词汇”PS 致癌物质不仅仅通过口服,还通过吸入,接触,辐射等等唾液够不到的地方作用人体。还有遗传,病毒,等等方式。经口致癌物只是少数罢了。即使唾液真有奇效,也不能一定防癌。另外,正规的文章在引用他人的研究结果时,要给出出处,而不仅仅说某某大学的研究结果,这样完全无法找回到原文。凡是找不回原文的引用,都属于无效的引用。例:“美国 乔治亚大学 曾有科学家做实验”如果这个实验是几十年前做的(曾有),那还可信吗?如果可信,为什么没有后续研究?如果有后续研究,为啥没有产品?看到这样的引用时,这些问题就会自动跳出来。在阅读科普类文章时,发现此类引用,其中的内容不可以当真。

重磅！非因指南性综述引领液体活检蛋白组技术新风尚!

2022年2月15日，非因生物以第一作者和通讯单位、联合美国纽约圣约翰大学陈哲生教授等在《Molecular Cancer》杂志上（ IF：27.401 ）发表了题为“Proteomics technologies for cancer liquid biopsies”的综述性文章，回顾了包括RPPA在内的多种高通量蛋白质组学技术在肿瘤液体活检中的研究进展及临床转化应用策略。

本文简要介绍了能够从液体活检样本中同时检测至少数百种蛋白质的高内涵蛋白质组学技术原理（图1），包括：RPPA反相蛋白微阵列技术（非因生物提供）、质谱技术、抗原/抗体阵列技术、基于核酸适配体（Aptamer）的检测技术和邻位延伸技术（PEA），并比较了上述各技术的优劣势（表1，嫌长不看也要看的表），同时介绍了各技术在癌症液体活检研究领域和临床转化方向的应用进展。（ 原文链接： ）

蛋白组学液态活检生物标志物研究背景

与肿瘤诊断的“金标准”组织活检相比，液体活检可通过最小入侵方式获得检测样本，同时克服异质性，实现动态监测。目前用于液体活检的体液主要为血液和尿液，但理论上，液体活检适用于任何人体内循环或其他人体相关的液体（图2）。作为大多数细胞功能的直接执行者和当前大多数癌症治疗中的直接药物靶标，多重蛋白质组学数据的分析，可能会在癌症进展的所有阶段实时提供更加宝贵的临床相关信息。液体活检样本中的蛋白质组具有巨大复杂性，如蛋白质丰度和翻译后修饰持续且快速的变化，同时蛋白质组技术与高度复杂的测序技术相比仍存在一定局限性，导致蛋白质组学的探究仍然落后于基因组技术，且目前临床转化效率极低，仅通过40多个基于液体活检的蛋白组生物标志物。因此，迫切需要新的蛋白质技术来实现在癌症液体活检中发现生物标志物的目标。

各技术比对

一、 质谱技术（MS）

由于体液样本中蛋白的复杂性，现代质谱技术通过不断优化样本制备方法、开发蛋白定量技术以及改变质谱扫描模式来提高检测精度。质谱法无需假设驱动，可以无偏倚地对样本中的蛋白进行扫描，因此可作为癌症体液样本早期生物标志物发掘的首选方法。目前基于质谱的生物标志物策略主要有：（1）在发现、核实、验证三个阶段，样本数量递增，而检测蛋白范围逐渐缩小的 “三角策略” ；（2）在发现和验证阶段均用“鸟枪法”在大样本队列检测尽可能多的蛋白，平行分析显示共同显著差异的蛋白可作为准生物标志物的 “矩形策略” 。目前基于质谱的液体活检已应用于卵巢癌、泌尿系统癌症、结直肠癌等多种癌症。但如想将质谱应用于广泛的临床试验，还需简化和标准化检测流程、提高检测的通量、精度和鲁棒性，并突破对翻译后修饰蛋白的检测局限性。

二、抗原/抗体阵列技术

抗体阵列 是将特异性抗体固定到带有修饰的平面基质上，通过荧光、化学发光或寡核苷酸标记的方式对样本进行多重靶标（通常为几百种）检测的方式。适用于血清学分析，如肿瘤相关的低丰度分泌蛋白的检测。但受到检测通量、检测动态范围、以及批次效应和信号饱和度、定量精确度的限制，抗体阵列仅可作为基于体液的蛋白组学分析的方法学之一。 抗原阵列 又称功能蛋白阵列，可作为抗原检测平台来检测抗体组成的细微变化，其早期热点应用是通过血清自身抗体（AAB）来进行生物标志物的研究。最全面的人类抗原阵列覆盖超过81%的蛋白，是血液蛋白全景分析的强有力的工具。但抗原阵列的靶点扩展、可重复性、批次效应和高昂的成本，仍使抗原阵列的应用有所局限。

三、 基于适体的检测

SOMAscan是目前高通量蛋白组检测的“新贵”工具，基于能够与不同蛋白质进行紧密结合的慢速率修饰的蛋白质适体（SOMAmer）进行检测。SOMAmer是寡核苷酸配体，结合上可光解的接头或荧光标签，通过构象识别与待测靶标结合，经生物素介导的纯化后，紫外光照射洗脱SOMAmers，并对其进行表征和定量已反应待测样本内的蛋白丰度。该方法具有超高特异性和亲和力，以及较低的批次间差异，目前可平行分析7000+种蛋白质，在结直肠癌和非小细胞肺癌的临床相关的生物标志物筛选中起到关键作用。但与抗体检测相比，现阶段可供研究使用的适体种类有限，尤其是翻译后修饰蛋白为导向的适体开发仍处于初期阶段。同时由于适配体对抗原决定簇的超高亲和力，在蛋白标志物研究的进程中会受到大量信号干扰，影响检测准确度。

四、邻位延伸技术（PEA）

PEA结合了基于抗体的免疫分析（ELISA）和PCR或二代测序（NGS）技术，与质谱检测相比，实现了用更低的样本量检测更广泛的动态范围，高灵敏、高准确、可重复且高保真识别。最先进的PEA检测目前由Olink商业化，可对3072个靶标进行标准测量。PEA首次应用于结直肠癌血液预后标志物的鉴定，后续应用于卵巢癌、前列腺癌等癌种的早期检测、伴随诊断和疾病监测。PEA检测与读取方式（qPCR、NGS）相关，当进行大队列样本分析时，仍需考虑实验误差和批次效应，其次翻译后修饰蛋白的研究对于抗体对开发具有很大瓶颈，对其捕获受到一定限制。

五、反相蛋白微阵列技术（RPPA）

RPPA起源于20年前，是将完全变性的蛋白裂解液固定在特殊载玻片上，通常每种裂解液会进行浓度梯度稀释，接下来用验证好的高度特异性的抗体孵育点样后的载玻片，通过信号放大化学显色或荧光检测捕获定量信息（图3）。RPPA可广泛应用于几百到超过一千个大样本的超稳健平行分析，定量精准，可对500+种细胞表面受体蛋白、细胞信号关键蛋白及蛋白修饰（磷酸化、乙酰化、甲基化等）、蛋白酶类、转录因子等各类代表性靶标进行分门别类的系统深度检测，包括直接和间接的上下游蛋白网络分析。基于以上特征，RPPA广泛应用于癌症基因组图谱项目（TCGA），其公共数据集可在线获取（TCPA，）。RPPA由于其最小的批次差异，可以作为蛋白质生物标志物验证的强大工具，并已成功应用于肺癌的新型生物标志物验证。另外，对外泌体蛋白的检测也成为RPPA在癌症液体活检中的另一项热点应用。 非因生物在国内搭建了基于MD安德森金标准的RPPA分析技术平台，先期完成了一系列工作流程的开发、验证及优化，不断扩展抗体库，并且建立了完备的生信分析体系。帮助国内科研，临床及工作者及广大药物研发相关用户快速高效开展疾病，尤其是肿瘤相关信号通路全景分析、分子机理挖掘、肿瘤相关药理学研究及靶向药物开发。RPPA复杂的技术流程和严格的抗体筛选过程将不再成为国内科研工作者的开展基础和转化医学研究的绊脚石。（点击下方“ 阅读原文 ”，了解详情）

展望

未来，在蛋白质组学技术不断发展的前提下，各技术之间的联合互补应用可以作为可行的、基于肿瘤体液活检的生物标志物正交验证策略(如图4所示)。非因生物依托RPPA技术等各项新型组学技术，将肿瘤精准治疗研究和转化作为核心使命，我们期待着一个更加精简但连贯且标准的蛋白类生物标志物开发流程的出现，并最终应用于癌症转化医学研究。

什么是液体活检，CTC, cfDNA, ctDNA ？？

液体活检（Liquid biopsy）也称为液体活检或液相活检，是对非固体生物组织（主要是血液）的采样和分析。

像传统的活检一样，这种类型的技术主要用作癌症等疾病的诊断和监测工具，其主要优点是无创。因此，它也可以更频繁地完成，从而可以更好地跟踪一段时间内的肿瘤和突变。

通过在几周内进行多次液体活检样本，它也可以用于验证癌症治疗药物的有效性。该技术也可能对治疗后监测复发的患者有益。

目前FDA已经验证并批准了采用CellSearch方法（金标准）对乳腺癌，结肠癌和前列腺癌中循环肿瘤细胞进行计数及进行预后分析。

循环肿瘤细胞（CTC，Circulating tumor cell）是从原发性肿瘤脱落到脉管系统或淋巴管中的细胞，并在血液循环运输到全身。

CTC可以扩散并成为随后在远处器官中其他肿瘤（转移）生长的种子，该机制是导致绝大多数与癌症相关的死亡的原因。

CTC的检测和分析可以帮助患者进行早期预后并确定适当的量身定制的治疗方法。

当前，有一种FDA批准的CTC检测方法CellSearch可用于诊断乳腺癌，结肠直肠癌和前列腺癌。

与传统的组织活检相比，CTC的检测或液体活检具有多个优势。它们是非侵入性的，可以重复使用，并提供有关转移风险，疾病进展和治疗效果的更多有用信息。

例如，随着疾病的发展，验血容易，安全，并且可以随时间采集多个样本。相比之下，对实体瘤的分析需要侵入性手术，这可能会限制患者的依从性。随着时间的推移监测疾病进展的能力可以促进对患者疗法的适当修改，从而可能改善其预后和生活质量。

预后疾病进展的能力的重要方面是，当重复的CTC计数低且没有增加时，消除（至少暂时地）无需进行手术。

外周循环游离DNA（cfDNA，Circulating free DNA）是血浆中的的DNA碎片。

cfDNA是一个很大的概念，可以用于描述外周循环血液的各种形式的游离DNA，包括循环肿瘤DNA（ctDNA）和胎儿DNA（cffDNA）。

在癌症中，尤其是晚期癌症中，有证据表明，cfDNA水平升高。

还有证据表明，cfDNA会随着年龄的增长而在外周血中增加。

cfDNA已被证明是除癌症和胎儿检测以外的多种疾病的生物标志物。例如创伤，败血症，无菌性炎症，心肌梗塞，中风，移植，糖尿病和镰状细胞病。

cfDNA主要是细胞外的双链DNA，小片段（70至200 bp）和较大片段（21 kb）的cfDNA已被认为是前列腺癌和乳腺癌的准确生物标记物。

有不少文章证实了cfDNA源于癌症，并且cfDNA多见于晚期癌症患者。

cfDNA在循环血浆和其他体液中都存在，cfDNA释放到血液的原因有多种，包括原发性肿瘤，cfDNA在肿瘤发展过程中在血液中迅速增加的积累是由凋亡细胞和坏死细胞过度释放DNA引起的。外泌体也会主动分泌cfDNA，但仍不清楚这是cfDNA的主要来源是来自哪里。

循环肿瘤DNA（ctDNA，Circulating tumor DNA）是血液中与细胞无关的肿瘤片段DNA。

ctDNA不应与无细胞DNA（cfDNA）混淆，

后者是更广泛的术语，但是ctDNA则反映了整个肿瘤基因组，因此因其潜在的临床实用性而受到关注。

可以在各个时间点采取抽血形式的“液体活检”，以监测整个治疗方案中的肿瘤进展。

ctDNA直接源自肿瘤或循环肿瘤细胞（CTC）！

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参考：

NGS在肿瘤临床基因检测中的应用2

   组织活检（Tissue biopsy） 是肿瘤癌症诊断的金标准。组织活检通过外科手段获取组织，通过病理学检测（形态学和免疫组化）对肿瘤进行分型分期，确定良恶性；剩余组织通过分子病理检测可指导治疗方案的选择，进行预后预测等。然而，组织活检通过外科手段获取组织的同时，可能存在出血、疼痛、感染、肿瘤播散等风险。另外，临床实践中存在肿瘤癌症组织不可及的情况；对于有些位置较为特殊或者不能耐受的患者，组织活检风险更大。

   液体活检（Liquid biopsy） 通过血液或者尿液等体液对癌症等疾病做出分析诊断。目前，液体活检的主要应用领域之一是肿瘤的血液检测，即利用血液提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗；检测对象主要是血液中游离的循环肿瘤 DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTC）和外泌体（Exosome）等。与现有肿瘤组织活检相比，液体活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显着的优势，应用发展潜力巨大。

  NGS技术可以单次检测多个分子标志物，相比于只能单次少量靶标的传统的PCR、qPCR和dPCR等技术，具有明显的优越性。目前，依托于NGS技术，基于病理组织的多分子标志物检测（组织活检）和基于血液ctDNA检测的液体活检被广泛研究。然而，由于两种检测方式本身的差异，两种检测方式的结果可能存在不一致的现象 [1-2] 。

  在一项检测EGFR突变Meta-analysis研究中 [3] ，液体活检相比组织活检，总体上灵敏度为68%，特异性为98%。按照检测技术看，基于PCR技术的液体活检灵敏度为51%，特异性为97%；基于ARMS-PCR技术的液体活检灵敏度为66%，特异性为98%；基于测序技术的液体活检灵敏度为79%，特异性为98%。

  在一项比较NGS-based组织活检和液体活检一致性的综述中 [4] 可以看到：不同基因的一致性不一样；一些当前指南未推荐检测的基因存在漏检的情况，当前指南推荐检测基因的一致性分别为：ALK，53.60%；BRAF，53.90%；ERBB2，56.50%；EGFR，67.80%；KRAS，64.20%；MET，58.60%；RET，54.60%；ROS1，53.30% 。

  组织活检主要依赖于影像学检查，在肿瘤早期或术后无瘤期间，影像学上无占位效应，因此无法对对肿瘤进行早期检测，也无法有效跟踪治疗效果。但血液或其他体液中却可能存在一些肿瘤相关信息，例如肿瘤细胞释放的 DNA 片段或外泌体等，通过液体活检可以实现肿瘤早期筛查以及术后的复发风险预测等。然而，临床实践中有大量基于组织活检的经验，液体活检目前仍是一门新兴的技术，在临床实践中的应用还需进一步得到验证。目前看，两种检测技术在临床实践中相辅相成 [5] ，因根据实际情况和组织的可及性进行选择。