外泌体标志蛋白（外泌体标志蛋白Alix）

本文目录一览：

• 1、什么是细胞外泌体_细胞外泌体是什么？
• 2、中国专家发现阿尔茨海默病生物标志物，这个标志物是什么？
• 3、什么是外泌体？
• 4、脑脊液 | 生物标志物分类
• 5、细胞外泌体是什么？

什么是细胞外泌体_细胞外泌体是什么？

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。2007年， Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌 的 exosome可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，exosomes所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增，截止已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。

一类外泌体中常见的细胞质蛋白是Rabs蛋白，是鸟苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一种。它可以调节外泌体膜与受体细胞的融合，有文献报道称RAB4, RAB5和 RAB11主要出现于早期以及回收的核内体中，RAB7 和 RAB9主要出现于晚期的核内体。现有大量的研究发现外泌体中含有40种RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌体中富含具有外泌体膜交换以及融合作用的膜联蛋白（包括膜联蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌体膜上富含参与外泌体运输的四跨膜蛋白家族（CD63, CD81 和CD9)）、热休克蛋白家族（(HSP60, HSP70, HSPA5, CCT2 和HSP90以及一些细胞特异性的蛋白包括A33（结肠上皮细胞来源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈细胞来源)、CD86(抗原提呈细胞来源)以及乳凝集素（不成熟的树突状细胞）。其它一些外泌体中的蛋白包括多种的代谢类的酶（GAPDH, 烯醇化酶 1, 醛缩酶 1, PKM2, PGK1, PDIA3, GSTP1,DPP4, AHCY, TPL1, 抗氧化蛋白, P4HB, LDH, 亲环素 A,FASN, MDH1 和CNP）、核糖体蛋白（RPS3）、信号转导因子（黑色素瘤分化相关因子, ARF1, CDC42, 人类红细胞膜整合蛋白, SLC9A3R1）、粘附因子（MFGE8、整合素）、细胞骨架蛋白以及泛素等。

中国专家发现阿尔茨海默病生物标志物，这个标志物是什么？

近日，中国专家发现了阿尔兹海默病生物标志物，并发布了“外周血神经源性外体突触素预测无症状阿尔茨海默病”的研究论文在国际医学杂志《阿尔茨海默病和阿尔茨海默病》 ，而贾建平称：“这对阿尔茨海默病早期或无症状期进行有效诊断，可以为其早期干预赢得时间，从而提高治疗效果，降低发病率。” 接下来我们就来了解一下阿尔兹海默病和他的生物标志物：

①阿尔兹海默病。

阿尔兹海默病，也就是我们通常所讲的老年痴呆症，它是一种起病隐匿性的进行性发展的神经系统退行性疾病。它的主要症状就是记忆力衰退，认知能力下降，行为能力下降，生活能力下降等。它还会引起抑郁症，焦虑症等多种并发症，危害很大。当然在我们通常的认识当中，他的病因有以下两种，

第1，遗传：根据调查发现有痴呆家族史的家庭更容易得阿尔兹海默症。

第2，心理社会因素：据调查发现那些性格相对孤僻，兴趣相对狭窄，而且伴有重大事件发生的，都对阿尔兹海默症及其并发症有影响。

②可预测性。

根据近日的贾建平教授发布的论文来看，他们可在发病出现前5年至7年预测阿尔茨海默病的生物标志物。 因为根据目前的研究来看，仍没有有效的药物能够治疗阿尔兹海默症晚期，所以早期的预防十分重要，在预防与治疗时，能够延迟阿尔兹海默症，还没这样的到来，他们发现并验证了外周血神经源性外泌体突触蛋白可以作为在认知障碍出现前5年至7年预测阿尔茨海默病和轻度认知障碍的生物标志物。 所以早期的治疗十分重要，对于阿尔兹海默症治疗有明显疗效。

什么是外泌体？

外泌体是健康和疾病中细胞间近距离通讯的介质，影响细胞生物学的各个方面。[1]

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

脑脊液 | 生物标志物分类

参考资料：2018 Handbook of Clinical Neurology. The use of cerebrospinal fluid in biomarker studies.

脑脊液(CSF)中的多种成分，可用于多种目的的生物标志物研究，用于神经系统疾病通路中重要导联的诊断、预后、监测和识别。目前已广泛用于multiple sclerosis diagnosis和AD (tau蛋白的表达水平和磷酸化水平)的诊断。

由于需要通过腰椎穿刺获取脑脊液，属于侵入性取样，因此与其他样本（如血液）相比，脑脊液样本显得格外珍贵。

蛋白标志物主要有以下3种。

蛋白标志物的常用分析方法： ELISA（针对特定已知蛋白）和蛋白组学（蛋白质谱技术） 。CSF中的蛋白浓度比血浆中低大概200倍，因此需要高敏感度的方法来检测。

代谢物是细胞代谢的终产物或中间产物，参与能量转换、信号传导、表观修饰等过程。 CSF中最常用的代谢标志物是葡萄糖含量，其可作为感染、炎症、恶化等过程的标志物。

代谢组学方法：质谱分析法可分析了许多生物样品中不同的代谢物；核磁共振波谱法。

正常细胞在凋亡后会释放cfDNA,外周血中的cfDNA一般在150-200bp。CSF中的cfDNA主要用于 检测恶性肿瘤的体细胞突变或病原体感染 。肿瘤细胞释放的cfDNA的长度变化范围更广、可直接用于检测体细胞突变；CNS感染病原体后，来源于病原体的cfDNA可用于鉴定病原体。

检测方法：PCR（针对点突变）或全基因组测序

miRNA更加稳定，是内源性的非编码RNA，参与mRNA调控并介导多种细胞过程，通常长22-24核酸，并有发卡结构。

miRNA的异常表达模式已在多种神经退行性疾病中被报道 ，如multiple sclerosis, AD, trauma, CNS tumors.

检测方法：RT-PCR / qRT-PCR (针对特定miRNA); 二代测序（针对新的miRNA）

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在30–100 nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。

多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。其中 包含DNA、多种类型的RNA、脂质、蛋白和代谢分子等。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。

胞外囊泡（1-2um)和外泌体(30-100nm)已被视为神经退行性疾病和恶性肿瘤生物标志物研究的热点。

方法：超速离心获取外泌体，，然后提取其中的mRNA或DNA。

作者大篇幅介绍了CSF成分的不稳定性，指出有多种因素会影响到分析结果。将其分为两类：患者相关的因素和环境（实验处理）因素。

不同对照组的纳入标准不同，由临床标准和实验室标准组成 （Table 1.4)。

QAlb：血浆和脑脊液之间的蛋白浓度梯度是由血-脑脊液屏障功能引起的，脑脊液球蛋白和与白蛋白的比例变化称作蛋白商。

现在常通过组学（蛋白组学等）方法比较疾病早期的CSF和晚期的组织，来鉴定新的标志物。如常用的蛋白质谱法，但是目前能用于临床的标志物仍然很少，这主要归因于两点：一是目前的蛋白质谱的敏感度有限；二是CSF中蛋白含量很低。

另一个方法是利用多重抗体或aptamer-based芯片来提高抗体敏感性。这种芯片可以检测超过1000种蛋白。或者针对组织进行组学测定，找到差异表达蛋白，然后在CSF中检测这些蛋白；或根据溶解度和分泌亚型对CSF是否存在某些蛋白先进行预判。

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。