免疫细胞浸润实验分析方法（免疫浸润分析是什么）

本文目录一览：

• 1、ssGSEA 与CIBERSORT分析--肿瘤免疫浸润分析
• 2、ESTIMATE算法免疫浸润评分
• 3、细胞免疫功能检测常用有哪几种方法
• 4、免疫细胞表型分析除了流式细胞仪还有什么方法
• 5、小鼠基因组+差异基因分析，这5分+的也太简单了吧！
• 6、免疫浸润分析方法

ssGSEA 与CIBERSORT分析--肿瘤免疫浸润分析

GSEA、GSVA、ssGSEA和GO、KEGG富集分析之间的区别？

从输入的表达矩阵入手

1. GSEA的输入矩阵：差异表达分析后得到的矩阵！

一列基因名/ENTREZ + logFC值（记得按照logFC值从大到小排列）

2. GSVA的输入矩阵：列是样本、行是基因、单元格内是表达量【没有差异分析！】

3. ssGSEA 名字长得像GSEA，其实是GSVA的好兄弟，因为（single sample GSEA）人如其名，都单样本了还怎么做差异分析呢？没有差异分析怎么做GSEA呢？所以 ssGSEA就是单样本的GSVA

4. GO/KEGG的输入矩阵：它们连read counts都不要！只用提供基因名！

分析方法

1. GSEA：GSEA同时考虑了基因在整个表达谱中Rank of FoldChange 同一基因集中的基因在表达谱中的相互之间的距离。 通俗来讲，GSEA基于如下假设： 一个基因集中的基因在表达谱中所处的Rank越极端（高/低FoldChange） 基因之间的距离越短（Rank相近）= 该基因集越显著。

2. GSVA：更好理解！如果某个基因存在于某个通路，那就给它“一分”，不在就扣它“一分”，这样就能计算得到Enrichment Score（ES）。 这样，某个通路在某个样本中就会有一个最终的得分。所以看GSVA分析完之后的表达矩阵，变成了： 列是样本，行是通路，单元格是Enrichment Score（ES） 。

显示同一个样本，不同免疫细胞的浸润比例，总和是1.

结果输出：

每一列代表一个样本。可以清晰的看出，不同免疫细胞在肿瘤中的占比。

分组显示--箱型图

结果输出：

两种方法略有不同，但都是说明同一个问题，可以比较着看。

ESTIMATE算法免疫浸润评分

恶性实体瘤组织不仅包括肿瘤细胞，还包括与肿瘤相关的正常上皮和基质细胞，免疫细胞和血管细胞。基质细胞被认为在肿瘤生长、疾病进展和耐药性中起重要作用。

浸润性免疫细胞的作用与环境有关，虽然浸润性T淋巴细胞的抗肿瘤作用在卵巢癌中已被观察到，但在结直肠癌中，肿瘤的生长、侵袭和转移与肿瘤的生长、侵袭和转移有关.

对肿瘤组织中与肿瘤相关的正常细胞的全面了解可能为肿瘤生物学的研究提供重要的见解，并有助于开发可靠的预后和预测模型。

作者提出了一种新的算法，利用癌症样本转录谱的独特性质来推断肿瘤细胞的内容以及不同的浸润正常细胞，称为Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumour tissues using Expression data(ESTIMATE)。

作者重点研究基质细胞和免疫细胞，它们构成了肿瘤样本中主要的非肿瘤成分，并识别与肿瘤组织中基质细胞和免疫细胞浸润相关的特异性信号。通过进行单样本基因集富集分析(ssGSEA)，作者通过计算基质和免疫评分来预测浸润基质和免疫细胞的水平，这些构成了在肿瘤组织中推断肿瘤纯度的 ESTIMATE score的基础。

细胞免疫功能检测常用有哪几种方法

细胞免疫（CMⅠ）是由多种细胞相互作用的结果。免疫细胞间相互作用导致多种细胞因子的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定，因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂，且很难标准化。

一、迟发型过敏反应的体外检测方法

皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。

1．皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。

2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱生接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导至DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。

二、细胞免疫的体外检测方法

体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。

1．T细胞计数

（1）E花环法：人类T细胞表面有SRBC受体（CD2）能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合，经37℃培养5～10分钟放4℃过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%～80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。目前此方法已用来分离T细胞，而不用做T细胞计数。

（2）用单克隆抗体计数T细胞：将人的PBM分成三等份，分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体作第二抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3 细胞即总T细胞。正常人在PBM中T细胞占70%～80%。正常人的CD4 细胞和CD8 细胞之和应与CD3 细胞数一致。CD4 细胞与CD8 细胞的比值正常人约为2/1而艾滋病患者则比值小于1.7。

2．T细胞活化试验 T细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法，MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲（fromazan）产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。结果可用酶标检测仪（595mm）测量汇丰银行密度，做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数。

3．细胞毒试验 TC细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51Cr-Na2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合，于37℃培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50：1或100：1）靶细胞被杀伤越多，释放到上清液中的液游离的51Cr越多，且不能被其他细胞吸收。用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。

细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全，及经IgG介导的ADCC效应，或NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有意义的。

4．混合淋巴细胞的反应（MIR） 是体外研究T细胞的较好的方法，双向MLR常被用来筛选骨髓移植的供体。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养4～5天，在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合（靶细胞来自与刺激细胞相同的个体）如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞，可杀死活的细胞，根据靶细胞释放51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子）和LIF（白细胞移动抑制因子）来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的免疫酶技术，操作简单，并能定量以取代了MIF和LIF的测定。单个核细胞与分裂原一起培养24小时，然后测定清液中的IL-2活性。在细胞免疫功能缺损时，特别是AIDS病人，IL-2分泌明显降低。而有些疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、移植排斥反应等病人体内血清中IL-2水平升高，表明病人T细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中IL-2也可升高。

也可用酶联免疫吸附试验测定各种体液中活化的T细胞脱落的IL-2受体（CD25），一般来说IL-2的水平和IL-2受体水平是平行的，IL-2和IL-2受体的检测可用于对某些疾病的监测，如移杆排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治疗的病人。

对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查细胞培养上清液中细胞因子的生物活性或抗原性。现已可用核酸杂交技术，即从组织中或细胞中提取RNA，与同位素或酶标记的该种细胞因子的cDNA探针作分子杂交试验，即印迹（dot blotting）或Northern印迹，若查出有某种因子的mRNA存在，即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的能力。

免疫细胞表型分析除了流式细胞仪还有什么方法

朋友你好！

所谓免疫是指利用抗原抗体特异性结合原理对你目的蛋白进行染色或标记；所谓表型一般指某种特异性蛋白的表达。因此除了流式，你还可以用免疫荧光染色并用con-focal观察，事实上，只要你有目的蛋白的抗体以及直接或间接相连的标记物，那么其他任何手段（比如荧光标记物报告实验Luciferase）都是可行的。

希望帮到你，欢迎追问~

小鼠基因组+差异基因分析，这5分+的也太简单了吧！

Integrated bioinformatic analysis revealed biological processes and immune cells implicated in autoimmune hepatitis

综合生物信息学分析揭示了与自身免疫性肝炎有关的生物过程和免疫细胞

发表期刊：j cell physiology

发表日期：2021 Feb 17

影响因子：5.546

DOI:  10.1002/jcp.30246

一、研究背景

自身免疫性肝炎（AIH）是一种以慢性肝脏炎症、界面性肝炎、血清免疫球蛋白γ升高和非器官特异性自身抗体产生为特征的免疫介导的肝细胞破坏疾病。因此，非特异性免疫抑制是目前的标准疗法。研究显示，AIH的一个显著特征是肝脏中存在干扰素（IFN）-gamma产生的T-helper 1（Th1）细胞。

作为一种pleiotropic细胞因子，转化生长因子β1在免疫耐受的发展和维持中起着核心作用，并且已经证实它在各种模型系统中具有抑制自身免疫性疾病的能力。在AIH方面，一些研究表明，同种Tgfb1缺失的BALB/c小鼠会自发地、迅速地发生Th1介导的IFN-gamma依赖性坏死性炎症性肝病，从而建立了一个暴发性AIH模型。

二、材料与方法   

  1   数据来源

GSE9892：野生型（WT）代表野生型小鼠，Tko代表Tgfb1缺失的小鼠，ITko代表Tgfb1和Ifng缺失的小鼠；一个样本取自一只小鼠，每个基因型包含三只小鼠。

  2   分析流程

1）差异表达基因的鉴定：使用GEO2R，p 0 .05和│倍数变化|≥1.5

2）功能富集分析：使用Cytoscape与插件CluGO

3）免疫细胞浸润的评估：使用CIBERSORT

三、结果展示

01 - 差异表达基因的鉴定

每个个体的全球基因表达分布以小提琴图（图1a）的形式呈现。为了了解基因表达的改变，进行了三次比较，Tko与WT、ITko与WT、ITko与Tko。与WT组相比，Tko组有2451个基因上调，2894个基因下调；ITko组有2744个基因上调，1929个基因下调。与Tko组相比，ITko组共有2915个差异表达基因，其中1911个基因上调，1004个基因下调（图1b）。图1c-e中分散了每个比较的前50个DEG。

02 - 常见DEGs的功能富集分析

这三个比较产生了516个共同的DEGs（图2a），每个比较之间的DEGs的相互关系见图2b。对这些DEGs进行功能富集分析，GO分析显示，这些DEGs在生物过程中显著富集，包括对干扰素-γ的响应和先天免疫反应的正向调节（图2c）。相互关系分析表明，生物过程可分为几组，其中细胞对细胞因子刺激的反应、免疫反应的调节和先天免疫反应是富集的前三组（图2c）。

为了进一步了解这些常见差异表达基因的作用，我们进行了反应组途径富集分析，结果表明白细胞介素-1信号，免疫应答蛋白的磺酰化，通过ZBP1的放射免疫沉淀介导的核因子κB活化是最显著富集的途径之一，而相关性分析显示CD3和TCR zeta链的磷酸化、免疫系统、磷脂在吞噬作用中的作用、白细胞介素信号、葡萄糖代谢，与趋化因子受体结合的趋化因子是显著富集的途径组（图2d）。

03 - Tko组与WT组的DEGs分析

MA图显示了Tko组2451个上调基因和2894个下调基因的平均表达水平和FC变化（图3a）。对上调基因的GO分析表明，刺激反应的正调控、白细胞活化、免疫系统过程的（正）调控、定位调节和先天性免疫反应是最丰富的生物过程组（图3b）。通过对下调基因的分析发现，富集的生物过程主要分为代谢过程，包括有机酸代谢过程、脂质代谢过程和辅助因子代谢过程（图3c）。

为了增加对上调基因的了解，进一步进行了Reactome通路分析。结果显示，PD-1信号转导、Toll样受体级联、免疫系统中的细胞因子信号转导、干扰素-γ信号转导和基因表达/转录是分类最多的通路组（图3d）。然而，下调基因大多富集在细胞周期、免疫系统、脂类/甾体代谢和生物氧化等途径组（图3e）。

04 -   ITko组与WT组的DEGs分析

ITko组2744个上调基因和1929个下调基因的平均表达量和FC变化也通过MA图显示出来（图4a）。上调基因的GO分析将T细胞活化、细胞过程的正向调控、白细胞活化/迁移、细胞因子产生的调控、免疫系统过程的调控归为最重要的生物过程组（图4b）。下调基因富集在生物过程中，主要可分为代谢过程，包括有机酸代谢过程、脂质代谢过程和辅助因子代谢过程（图4c）。

Reactome通路分析表明，上调基因大多富集在Rho GTP酶信号传递、免疫系统、Fc伽马受体依赖的吞噬作用和免疫系统中细胞因子信号传递等通路组中（图4d）。下调基因在脂质/甾体/氨基酸的代谢、化合物的一期功能化、生物氧化剂和免疫系统等途径组中显著富集（图4e）。

05 - 与AIH缓解相关的DEGs分析

在Tko组上调的2451个基因中（与WT组相比），与Tko组相比，ITko组有472个基因下调（图5a）。对472个基因的GO分析表明，这些基因在免疫反应调控方面明显富集，可分为对其他机体的反应、防御反应的调控、免疫系统过程/免疫反应的调控和对细胞因子的反应/调控等组别（图5c）。Reactome通路分析也显示，这些基因主要富集在免疫系统通路中，显著富集的组别包括干扰素信号转导、IFN刺激基因的抗病毒机制、(适应性)免疫系统和葡萄糖代谢(图5d)。

此外， Tko组中下调的586个基因（与WT组相比）在ITko组中上调（图5b）。586个基因的富集分析表明，细胞-细胞信号转导、管发育和神经系统发育是最显著的分类组（图5e）。然而Reactome途径分析表明，细胞外基质组织、含TSR域蛋白的O-糖基化和跨化学突触的传递是富集度最高的途径组（图5f）。

06 - Tko小鼠和ITko小鼠特异性上调基因分析

与WT组相比，Tko组有1141个基因特异性上调，而ITko组有1434个基因特异性上调（图6a）。GO分析显示，Tko组中特异性上调的基因显著富集在生物过程中，主要可分为对细胞因子的反应、解剖结构形态发生、防御反应、免疫系统过程的调控和多细胞机体过程的调控等组别（图6b）。接下来进行了Reactome通路分析，总富集的通路主要可以归纳为免疫系统、免疫系统中细胞因子信号转导、白细胞介素的信号转导、止血、趋化因子受体结合趋化因子（图6c）。

对ITko组特异性上调的基因进行GO分析发现，这些基因大多参与的途径主要可归纳为（有丝分裂）细胞周期过程、有丝分裂核分裂的负调控、（微管）细胞骨架组织、蛋白质定位到染色体、DNA复制独立的核小体组装（图6d）。进一步的Reactome通路分析表明，这些基因显著富集在包括细胞周期、有丝分裂前分裂、核包膜分解、驱动蛋白和Emi 1的磷酸化等通路组中(图6e)。

07 - 分析Tko小鼠或ITko小鼠中特异性下调的基因

在下调基因中，Tko组特异性呈现1713个基因，而ITko组特异性呈现748个基因（图7a）。GO分析表明，ITko组中特异性下调的基因大多富集在生物过程中，可归纳为多细胞生物体发育、细胞通信调节、细胞大分子代谢过程和突触组织等（图7b）。Reactome通路分析表明，这些基因在免疫系统、GPCR信号传递、线粒体翻译终止、磷酸肌苷-3激活的AKT信号传递和细胞对应激的反应等通路组中显著富集（图7c）。

对Tko组中特异性下调的基因进行GO分析，发现这些基因在生物过程中显著富集，主要可分为有机酸/羧酸/脂质代谢过程、细胞对化学刺激的反应以及参与与共生体相互作用的宿主细胞的自噬（图7d）。进行Reactome通路分析，Tko组特异性下调基因的总富集通路主要可分为氨基酸及衍生物代谢、Toll样受体级联、钼辅基生物合成、COPII介导的囊泡运输和糖胺聚糖代谢等（图7e）。

08 - 免疫细胞浸润分析

为了深入了解不同条件下免疫细胞的组成，采用了CIBERSORT。各组的一般免疫细胞丰度如图8a所示。观察到先天免疫和适应性免疫共同调节免疫细胞（图S1）。结果显示，Tko组的T细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞增加，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、浆细胞和B细胞显著减少（图8a和图S1）。与Tko组相比，ITko组巨噬细胞和NK细胞减少，T细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞增加（图8a和图S1）。

CD4 T细胞是T细胞的主要类型（图8b）。尽管有些变化并不显著，但观察到CD4 T细胞和CD8 T细胞的免疫状态从幼稚转变为记忆的趋势（图8c）。此外，还观察到辅助性T细胞的亚群转移和巨噬细胞的表型转移（图8d和图S1）。

四、结论

总之，利用从可靠的AIH小鼠模型中获得的微阵列数据，作者全面揭示了该疾病所涉及的潜在生物学过程。发现AIH的发展与显著增加的免疫反应和急剧抑制的代谢过程有关。通过估计免疫细胞的浸润，发现了几种类型的免疫细胞的失调。一些免疫细胞的改变与临床发现一致，而其他免疫细胞的改变在AIH中的作用仍未被充分认识。本研究为理解AIH的发展提供了一个新的视角，这将有利于制定针对该病的有效治疗策略。

免疫浸润分析方法

肿瘤不是单纯的恶性细胞群，而是由不同类型细胞组成的复杂生态系统。在这些细胞中，肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤控制和治疗反应中起着核心作用。例如，细胞毒性CD8 + T细胞是抗癌免疫的主要效应因子，因为它们可以特异性地识别和杀死携带新抗原的肿瘤细胞。肿瘤特异性抗原主要来源于突变基因的表达。但免疫细胞也可以发挥免疫抑制作用，支持肿瘤发生和免疫逃避，如调节性T细胞。因此，对不同类型的肿瘤浸润免疫细胞进行定量研究，有助于阐明肿瘤免疫应答的机制、评价肿瘤治疗的免疫原性作用，最终指导设计合理治疗方案。 背景介绍 最著名的 标记基因分析方法 是基因集富集分析(GSEA)。基于GSEA的方法计算富集分数(ES)，当某一细胞类型的特异性基因在感兴趣的样本中处于高表达的前几位，而在其他情况下则处于低表达的前几位时，该分数较高。

基于GSEA的方法只能计算样本中细胞类型富集的半定量分数，而 反褶积方法 可以定量地估计感兴趣的细胞类型的相对分数。反褶积算法将异种样本的基因表达谱看作是不同细胞的基因表达水平的卷积，并利用描述细胞类型特异性表达谱的特征矩阵来估计未知的细胞组分。

下面是利用标记基因与GSEA或其他评分方法，或利用反褶积算法和免疫细胞表达特征，从 细胞混合物的表达数据量化免疫细胞 的计算方法。

下图是几个 从转录组学数据定量肿瘤浸润免疫细胞 的计算工具：

方法简介****01 基于标记基因的评分方法 （1）MCPcounter

一种基于标记基因定量肿瘤浸润免疫细胞（CD3 + T细胞，CD8 + T细胞，细胞毒性淋巴细胞，NK细胞，B淋巴细胞，单核细胞来源的细胞(单核细胞系)，髓样树突状细胞，中性粒细胞）、成纤维细胞和上皮细胞的方法。对于每个细胞类型和样本，丰度得分为细胞类型特异性基因表达值的几何平均值，独立地对每个样本进行计算的。由于分数是用任意单位表示的，它们不能直接解释为细胞分数，也不能在细胞类型之间进行比较。进行定量验证时，估计分数与真实细胞分数之间具有很高的相关性，证明了MCP-counter用于样本间比较的价值。MCP-counter已应用于对32个非血液学肿瘤的19,000多个样本中的免疫细胞和非免疫细胞进行量化。

（2）TIminer

TIminer是一个用户友好的计算框架，用于不同的肿瘤免疫基因组分析，包括(i)来自NGS数据的人白细胞抗原HLAs基因分型；(ii)使用突变数据和HLA类型预测肿瘤新抗原；(iii)来自大量RNA-seq数据来分析定量肿瘤浸润免疫细胞；(iv)通过表达数据量化肿瘤的免疫原性。

（3）xCell

xCell是一种基于ssGSEA的方法，能够计算64种免疫细胞的丰度分数，包括适应性和先天免疫细胞、造血祖细胞、上皮细胞和细胞外基质细胞。基于FANTOM5，ENCODE，Blueprint，Immune Response In Silico (IRIS)，Human Primary Cell Atlas (HPCA)和Novershtern等6个研究的489个基因集。对于每种细胞类型，计算xCell丰度分数的主要步骤有四个：(i)利用R包GSVA对489个基因集单独进行ssGSEA；(ii)对属于一种细胞类型的所有基因集的ES进行平均；(iii)平台特异性ES转化为丰度分数；(iv)使用与流式细胞术数据分析类似的spillover方法纠正密切相关的细胞类型之间的关系。

02 使用表达特征对细胞混合物进行反褶积 （1）DeconRNASeq

Gong和Szustakowski将约束回归模型应用于RNA-seq数据分析，并将其实现在R包DeconRNASeq中。混合五种人体组织(大脑、骨骼肌、肺、肝和心脏)的RNA-seq数据，通过合并组织类型特异性基因来估计组织或细胞类型的比例。并利用Illumina’s human Body Map 2.0中RNA-seq数据构建的特征矩阵，对算法进行了仿真验证。虽然还没有开发出新的免疫特征，但该工具原则上可以应用于任何特征矩阵。

（2）CIBERSORT

CIBERSORT算法利用微阵列数据构建特征矩阵，描述22种免疫细胞表型的表达特征，包括不同的细胞类型和功能状态的免疫细胞。CIBERSORT使用ν-SVR评估细胞分数。CIBERSORT分别在9个免疫细胞亚群和3个免疫细胞亚群的同时反褶积方面具有较高的准确性，在4种恶性免疫细胞的模拟混合物上测试，也证明了对不同程度的噪音和未知的肿瘤具有鲁棒性。

（3）TIMER

一个系统评估不同的免疫细胞对不同癌症类型的临床影响的资源。利用一系列免疫特异性标记和免疫细胞表达特征，来估计32种癌症类型中6种免疫细胞类型（B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的丰度。从RNA-seq或微阵列数据中提取的癌症表达矩阵与免疫细胞表达矩阵合并，并用Combat进行归一化，以消除批量效应。通过从免疫细胞标记中选择与肿瘤纯度负相关的基因，为每种癌症类型分别识别特征基因。最后，对于每种癌症类型，考虑到所选的免疫细胞标记，从标准化的免疫细胞配置文件构建特征矩阵。TIMER使用线性最小二乘回归方法执行反褶积，并强制所有负估计为零。用越来越小的一组T细胞标记重复估计几次，以减少CD8 +和CD4 + T细胞比例之间的相关性。与CIBERSORT不同的是，最终的估计并没有被规范化，因此不能直接解释为细胞组分，也不能在不同的免疫细胞类型和数据集之间进行比较。

（4）EPIC

Estimate the Proportion of Immune and Cancer cells (EPIC)，用来估计免疫细胞和癌细胞比例。EPIC使用约束最小二乘回归明确地将非负性约束引入反褶积问题，并要求每个样本中所有细胞组分的总和不超过一个。EPIC克服了以往从大量肿瘤基因表达数据预测癌症和免疫细胞或其他非恶性细胞类型的方法的几个局限性，考虑了非特征性和可能高度可变的细胞类型，并在算法上得到了发展。能够广泛应用于大多数实体肿瘤，如黑色素瘤和结直肠样本验证的情况，但不适合血液恶性肿瘤，如白血病或淋巴瘤。

（5）quanTIseq

quanTIseq是专门为RNA-seq数据开发的反褶积工具，能够准确定量未知肿瘤的含量，以及量化整体组织的免疫细胞组份。基于约束最小二乘回归和一个新的特征矩阵（来自51个纯化或富集的免疫细胞类型的RNA-seq数据集）。quanTIseq实现了一个完整的反褶积流程来分析RNA-seq数据，能够避免混合物和特征矩阵之间的不一致性。

03 细胞组分和表达谱的同时反褶积 （1）DSA

数字排序算法Digital Sorting Algorithm—DSA是一个完整的反褶积算法，它基于一组从混合组织样本中提取在特定细胞类型中高度表达的标记基因，利用二次规划来推断复杂组织中的细胞组分和表达谱。该算法在三种恶性免疫细胞系混合的微阵列数据上进行了测试，重建了真实的细胞组分和表达谱。该算法是无偏的，不需要细胞类型频率的先验知识。

我总结 今天我们简单介绍了一些关于免疫浸润的方法，之后会有更多详细的压箱底使用方法分享，不要错过呀。REF:Finotello, F., Trajanoski, Z. (2018). Quantifying tumor-infiltrating immune cells from transcriptomics data. Cancer immunology, immunotherapy : CII, 67(7), 1031–1040.