多色荧光免疫组化仪器（荧光免疫组化法）

本文目录一览：

• 1、多色免疫组化实验原理(mIHC)
• 2、多重免疫组化（mIHC）和免疫荧光的区别
• 3、七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（抗兔二抗）
• 4、荧光免疫组化所用实验仪器及设备应该有哪些
• 5、采用TSA技术的多重荧光免疫组化染色试剂盒哪家好？

多色免疫组化实验原理(mIHC)

    多色免疫组化（Multi-color IHC）简称多标，顾名思义在同一张切片上标记多个抗体，通过不同的颜色来共定位蛋白的表达。其原理仍然是利用了抗原抗体的特异性结合，与免疫组化和免疫荧光，甚至于western blot的原理异曲同工。常用的是用石蜡切片做多色免疫组化，这是因为石蜡包埋可以保持组织形态的完整，染色后的图片质量高。不用冰冻切片的目的是超低温形成的组织内冰晶容易损伤细胞结构，导致抗原弥散。虽然石蜡切片经过烘片和抗原修复对抗原有一定影响，但对于抗原性较好的蛋白，这一步的影响可以作为此要考虑的问题。

    我的课题与肝脏相关，所以做多标的样本自然是肝脏。对于肝脏冰冻切片的效果还有待实验验证，目前在做的是石蜡切片的多标，所以以此为出发点讲解一下“巴菲尔”公司的Opal多标染色方法。具体的实验原理即酪胺信号放大技术（TSA, Tyr Signal Amplification)。原理上简单来说，利用二抗后面偶联的HRP来催化后续加入体系的非活性荧光素(Opal 染料)。Opal染料的稀释液中带有过氧化氢，HRP和过氧化氢反应产生游离氧，结合opal染料，使其变成一种活性中间态。这种活性中间态能无差别结合蛋白上的酪氨酸残基，而后在特定波长的激发光下发出荧光。这里需要强调的是，中间态与Tyr残基的结合无差别，无论是一抗和二抗，还是信号蛋白，都能结合。当用Striping buffer剥抗体的时候，一抗（包括一抗）后面的所有结合物都被剥离，只剩下信号蛋白上结合发光基团。

    这种方式的好处是不需要考虑抗体的种属问题，只需要选择好用的一抗，二抗可以用同一种抗一抗的二抗。无论是配色，还是抗体的搭配都很简单。唯一让我觉得欠缺的一点就是试验周期长。比如，我需要染三色（包括DAPI），就需要三天时间，四色需要四天，七色需要七天。另外，一抗用于做多色免疫组化还需要不断摸索抗体的最佳浓度，所以周期会较长。不像免疫荧光，时间相对短很多。

关于光谱，有激发光(Excitation)和出射光(Emission)，图中标出的是Emission。在说法上，与流式中的配色光谱有差别，流式中写的是激发光，而多色免疫组化中写的是出射光。

Ref：

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多重免疫组化（mIHC）和免疫荧光的区别

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IF ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

多重免疫组化（mIHC）：主要的技术原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该技术可与高性能染料Alexa Fluor®、传统荧光染料和比色检测系统相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大。

mIHC和IP的区别：

七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（抗兔二抗）

| 概述 | |

| 描述 |

组织微环境中有复杂的细胞组成，这些细胞的表型、状态、丰度、分布都有着重要的生物学意义和临床价值。借助抗体染色可以将其在组织原位上呈现出来。免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，常规IHC检测只能展示单一指标，难以呈现复杂的组织微环境中的细胞组成、状态和关系，而这些信息对疾病的诊断和治疗至关重要！

酪氨信号放大技术原理：类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生产活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定的共价结合荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的抗体，在换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

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| 检验原理 |

多重荧光免疫组化染色是基于抗原、抗体特异性结合的原理，选用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗抗体，对试剂盒中的荧光染料进行活化，将信号共价结合到抗原上。借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色。

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| 产品组成 |

TSA单色荧光染料520、TSA单色荧光染料540、TSA单色荧光染料570、TSA单色荧光染料620、TSA单色荧光染料650、TSA单色荧光染料700、信号放大反应液、抗兔HRP标记二抗、抗荧光淬灭封片剂、DAPI.

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| 应用 |

主要用于人源或小鼠组织、石蜡切片、TMA芯片的免疫组化染色。

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| 使用方法 |

1. 荧光染料的稀释：若染料为干粉，使用100ulDMSO溶解，制成100X染料母液；若染料为液态表示出厂即为DMSO溶解的100X母液；使用信号放大反应液按1:100稀释制备染料工作液（现用现配）；DAPI使用无菌水按1:100稀释制备工作液。 2. 二抗的使用：试剂盒为抗兔二抗，适用小鼠组织，实验前请核实一抗种属是否匹配。人源样本请参考（# abs50015 ）。

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| 性能 | |

| 储存/保存方法 |

荧光染料需避光保存，2～8℃储存，收到货起有效期为12个月。

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| 注意事项 |

1. 本试剂盒只用于免疫组化，不做其他用途。

2. 本试剂盒仅限于专业人员使用。

3. 应采用适当的防护措施，以避免试剂同皮肤和眼睛接触。

4. 超过有效期的试剂活性可能降低，因此不得使用超过有效期的试剂。

5. 若将本试剂盒的染色组分与其他公司的产品混合使用，在染色过程中可能出现异常情况。

6. 脱蜡不彻底，容易影响染色效果。

7. 为了防止可能出现的假阴性、假阳性结果，实验过程中需有阳性对照及阴性对照同时进行。

8. 使用本试剂盒中所产生的各种废弃物都应按照《医疗废物管理条例》进行处理。

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| 参考文献 | |

| 参考文献 |

1.Dabbs David J. 诊断免疫组织化学(M). 北京：北京大学医学出版社，2008.9.

2.【美】Ed Harlow, David Lane. 抗体技术指南(M). 北京：科学出版社，2002:79-80,105.

3.Stack, E. C., et al., Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods, 2014 70 (1): 46-58.

4.钱帮国. 焦磊. 多标记免疫荧光染色及多普成像技术在组织学研究中的应用. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2017 (4): 373-382.

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荧光免疫组化所用实验仪器及设备应该有哪些

石蜡或冰冻切片机，好的正置生物显微镜。

做好的切片，6个染缸，1个5公斤的广口瓶，1个湿盒，1个洗瓶，1个摇床，1个孵箱，1个天平，1卷草纸，1个显微镜（根据需要选择荧光显微镜或光学显微镜）。

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采用TSA技术的多重荧光免疫组化染色试剂盒哪家好？

上海爱必信多重荧光免疫组化染色试剂盒，采用TSA技术，基于酪酰胺的信号放大技术能够检测用传统方法无法检出的低丰度靶标，且无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。