外泌体mirna研究（如何检测外泌体中的miRNA）

本文目录一览：

• 1、外泌体miRNAS数据库已收录多少条
• 2、外泌体多组学19-外泌体miRNA分选机制motif研究
• 3、细胞外miRNAs：从生物标志物到生理和疾病的调节因子
• 4、脂肪组织巨噬细胞来源的外泌体miRNA可在体内和体外调节胰岛素灵敏度

外泌体miRNAS数据库已收录多少条

截止目前外泌体数据库Exocarta显示，已有9769种蛋白质，3408种RNA，2838种miRNA及1116种脂质在外泌体中被发现()。相比较蛋白质，RNA，miRNA的研究，外泌体脂质的研究相对较少。

外泌体多组学19-外泌体miRNA分选机制motif研究

外泌体和其他小的胞外囊泡(sev)提供了一种独特的细胞间通信模式，在这种模式中，从一个细胞产生和释放的microrna(miRNAs)被远处的细胞吸收，在那里它们可以引起基因表达的变化。然而，mirna被分选到外泌体/sev或保留在细胞中的机制仍在很大程度上未知。

在这里，我们证明了miRNA具有分选序列，决定其在sEV（EXOmotifs）或细胞保留(CELLmotifs)中的分泌，并且不同的细胞类型，包括白色和棕色脂肪细胞、内皮、肝脏和肌肉，优先使用特异性分选序列，从而定义该细胞类型的sEVmiRNA谱。

为了研究miRNA细胞保留和外泌体/sEV释放的具体特征，我们从5个小鼠细胞系中分离出了外泌体/sEV，这些细胞系代表了参与代谢调节的重要组织：

不同类型的细胞释放不同数量的sev，3T3-L1脂肪细胞的产生和释放率最高，C2C12肌管的释放率最低；这与观察到的脂肪组织是体内循环外泌体/sEVmirna的主要贡献者相一致

在所有病例中，sev的直径为50-200nm。

富集经典的外泌体标记物ALIX、TSG101、CD9和CD63，而细胞标记物GM130和CANX基本没有

这些sev的RNA含量与释放的囊泡总数相平行

使用基于实时荧光定量PCR(qPCR)的阵列评估分泌的sev及其来源的细胞的miRNA组成(图1a)。与预期的一样，细胞miRNA的主成分分析(PCA)显示，尽管棕色和白色的脂肪细胞和内皮细胞聚集在一起，而肝细胞和肌细胞更为不同，但每种细胞类型都有不同的miRNA谱。

当PCA同时包括细胞和sEVmiRNA时，sEVmiRNA彼此之间以及与其来源细胞中的miRNA有很大的不同(图1b)，突出了miRNA分泌的特殊性

然后，我们比较了每种细胞或sEV类型中每个miRNA与其他类型的水平。在细胞体中评估的664个miRNAs中，有210个miRNAs（32%）在一种细胞类型中的表达明显高于其他四种细胞类型

同样，与其他细胞类型的囊泡相比，大约三分之一的sEVmiRNAs（218/660）在一种细胞类型的囊泡中富集，可用于预测来自不同器官的混合sev中的组织来源，如在血液中。

一些sev特异性的miRNA反映了miRNA的细胞类型特异性，例如，miR-133a/b，它在C2C12肌管中特异性表达。

然而，对于每种细胞类型，73-92%的被认为是针对特定细胞类型的sEVmiRNAs也在其他细胞类型的细胞体中以类似或甚至更高的水平表达，提示了一种细胞类型特异性的分类机制。同样地，在两种不同细胞类型的sev中同样丰富的miRNA在两种分泌细胞类型中可能有相当不同的表达水平。因此，确定sEVmiRNA的组织起源并不像知道miRNA在哪个组织中高表达那么简单（上图e）。

通过比较细胞体中每个miRNA与sev的相对水平可以揭示miRNA分泌和保留的独特模式。

与细胞体相比，一些mirna在所有五种细胞类型的sev中均富集，而其他的则在只有一种或两种细胞类型的sev中表现出选择性富集，还有一些发现在sev中很少或根本没有发现，尽管它们存在于细胞体中。

将sEV中miRNA的相对丰度除以其在细胞体中的相对丰度(sEV富集)，表明sEV和细胞中miRNA的分类存在大量差异，一些miRNAs在sEV中明显富集，而另一些在细胞体中明显富集（保留）.

为了确定miRNA分选的潜在机制，我们分析了显示sEV或细胞体富集的miRNA的miRNA序列和结构。5p和3pmiRNAs没有普遍富集（补充表6）。然而，与细胞中保留的序列相比，sEV富集水平更高的miRNA序列具有更高的G+C含量和更低的吉布斯自由能(ΔG)(扩展数据图2c，d).

识别潜在的差异分选miRNAs序列，我们分析在sEV或细胞体中富集的miRNAs的序列，将它们与未显示出优先sEV分选或细胞保留的mirna序列进行比较。

细胞外miRNAs：从生物标志物到生理和疾病的调节因子

原文链接： Cell Metabolism 30, October 1, 2019. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. IF: 22.415

miRNAs可在血清和其他体液中发现，并可作为疾病的生物标志物。更重要的是，分泌型miRNAs，尤其是胞外囊泡(EVs)如外泌体分泌的miRNAs，可能介导不同组织间的旁分泌和内分泌通讯，从而调节基因表达和远程调控细胞功能。分泌型miRNAs受影响时可能会导致组织功能障碍、衰老和疾病。 脂肪组织是循环外泌体miRNA的重要来源。 在许多代谢条件下发生的脂肪组织质量或功能的改变可以导致循环miRNA的改变，从而引起机体一系列的功能改变。

这篇综述回顾了得出这些结论的研究，并讨论了如何为新的研究奠定基础，有助于进一步确定细胞外miRNA作为细胞间通讯的重要介质如何发挥强大作用。

综述分为以下几个部分：

MicroRNAs (miRNAs)是由体内各种细胞产生的约22个nt的调节性非编码小RNA。许多miRNAs在进化过程中高度保守，尽管它们的多样性和数量与机体的复杂性相关。秀丽隐杆线虫的基因组包含437个miRNAs，小鼠超过1500个，而人类的miRNAs在2000到3000个之间(数据来自miRBase，第22版)。许多miRNAs可以无所不在地表达，而其他的则具有组织特异性。这种分布模式是由细胞内miRNA前体的转录和转录后调控所驱动的。

在细胞核中，初级miRNAs(pri-miRNAs)被RNA聚合酶II转录，然后由微处理器复合物(内含核糖核酸内切酶DROSHA及其RNA binding partner DGCR8)或剪接机制的组件进行处理。这导致了约70个nt的pre-miRNAs，被XPO5和Ran GTPase输出到细胞质中。pre-miRNAs被III型核糖核酸内切酶DICER和RNA结合蛋白TRBP与PACT共同处理，产生双链miRNAs duplex。这些miRNAs duplex被加载到RNA诱导的沉默复合体（RISC），在RISC中，Argonaute-2 (AGO2)及其分子伴侣HSC70/HSP90介导双链miRNAs duplex的一条链与其靶mRNA结合（另一条链一般很快被降解了），抑制mRNA的翻译和/或加速mRNA的降解。也有一些miRNAs发挥非常规的相反作用：诱导转录和上调蛋白表达的。不依赖DICER的miRNA生成也有报道，但它们的影响有限。

与mRNAs类似，miRNA表达谱也可作为细胞标志物。例如，miR-122在肝脏中高度表达，占该组织中总miRNA表达量的70%。肌肉细胞中富含miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-208a、miR-208b、miR-486和miR-499，因此这些miRNAs被称为myomiRs；miR-9和miR-124几乎完全在大脑中表达，后者占了该组织中近50%的miRNA含量；而β细胞是唯一高丰度表达miR-375的细胞。另一方面，一些细胞，如脂肪细胞和干细胞，表达多种miRNAs。

为了理解miRNAs 的表达如何在特定细胞类型中促进该组织的发育和稳态，产生了多种 细胞类型特异性DICER或DGCR8敲除小鼠 。中枢神经系统、胰腺、骨骼肌和心肌的DICER敲除使小鼠不能成活或出现严重的发育缺陷。而肝脏特异性DICER敲除小鼠(LDicerKO)和脂肪细胞特异性敲除小鼠DICER (ADicerKO)或DGCR8 敲除小鼠(ADgcr8KO)在成年之前与野生型的幼鼠难以区分，直到它们开始出现代谢功能障碍。包括LDicerKO小鼠肝脂质沉着症和早发性肝细胞癌；ADicerKO和ADgcr8KO小鼠部分出现脂肪营养不良和胰岛素抵抗。许多表型是因为miRNAs生成受阻改变mRNA半衰期和细胞的翻译功能，但是有一些表型因为其他组织中基因表达和功能的变化引起的二级改变，提示细胞非自治组织miRNAs损失的影响。当ADicerKO小鼠移植正常脂肪组织后，其肝脏基因表达发生逆转，提示这些变化受脂肪组织分泌的miRNAs调控。这种现象产生一个假象：每个细胞的miRNAs是内源性miRNAs产生和外源性miRNAs摄取的总和。要证实这一假设，就需要发展稳健的技术来追踪miRNAs起源和运输。

miRNAs可以通过囊泡转运和蛋白载体的机制被细胞输出和导入是miRNAs具有潜在的细胞和组织间通讯作用的强有力支持。这个概念最早是由Valadi等人在 2007年 提出的，他们在不同细胞系分泌的胞外囊泡(EVs)中识别出大量的mRNAs和miRNAs，这些囊泡可以被其他细胞吸收，然后将mRNAs和miRNAs释放到靶细胞中。 2010年 有研究表明，体液中存在miRNAs，且它们的水平与疾病进展相关。从那时起， 细胞外miRNAs转运机制 被广泛研究，目前已知 的两条主要途径 是： (1)通过EVs主动转运；(2)作为蛋白-miRNA复合物的一部分转运 。此外，可能有一些miRNAs是从破损或受损的细胞中泄漏出来的。

通常，多泡体(MVBs)与质膜融合产生的较小的EVs ( 200nm )称为外泌体(图1)，而质膜直接向外出芽和裂变形成的较大EVs ( 200nm )称为微囊泡。直接出芽也能产生类似外泌体的小泡，被称为梭状囊泡或胞外体。

除EVs外，miRNAs还可能在含有蛋白复合物的血液中被运输。这些复合物也可以进入细胞并传递miRNAs来抑制靶mRNA。 低密度(LDL)和高密度(HDL)脂蛋白 都可以在循环中运输miRNAs。在HDLs的情况下，结合的miRNAs可以通过B类I型清道夫受体被受体细胞吸收并在细胞内释放从而调节受体细胞基因表达。

尽管EVs相关和脂蛋白结合的miRNAs在功能上很重要，但它们只是占循环中发现的所有miRNAs的一部分。在一些研究中，在人类血清中发现超过一半的miRNAs可能与核糖核酸蛋白结合，包括argonaute ( AGO2 )；然而，其中只有一小部分是通过这种方式运输的。核仁蛋白核磷蛋白1 (nucleophosmin 1, NPM1 )也被发现可以携带和保护细胞外miRNAs不被降解。

生物标志物是一种可以用于疾病检测和/或预后预测的分子。一个好的生物标志物最重要的四个特征是特异性、敏感性、稳定性和非侵入性。 循环miRNAs水平的变化与多种疾病相关，包括2型糖尿病(T2D)、肥胖、心血管疾病(CVD)、癌症、神经退行性疾病等。

这部分内容参考我写的 ChemicalReviews综述 ，那里面有更详细的描述。

脂肪组织的功能除了以甘油三酯的形式储存能量外，还能分泌调控全身新陈代谢的分子来维持机体内环境平衡。这些分子包括脂肪产生的激素(被称为脂肪因子)，信号脂质，炎症介质和EVs miRNAs。 ADicerKO小鼠约三分之二的循环miRNAs显著减少，这表明了脂肪组织对循环miRNAs库的显著贡献。 患有各种脂肪营养不良的患者，其循环外泌体miRNAs也有显著改变。重要的是，脂肪组织分泌的miRNAs已经被证明可以到达肝脏和肌肉等器官，并调节该组织基因和蛋白质的表达。

脂肪来源的循环miRNAs以内分泌方式控制代谢稳态的一个例子是2017年Thomou等人通过脂肪来源的miR-99b调控肝脏FGF21。 ADicerKO小鼠循环EVs中的miR-99b水平降低，肝脏中Fgf21 mRNA及3' UTR-报告基因活性的上调，这两种现象可通过往循环中加入含有 miR-99b 的EVs显著纠正。ADicerKO小鼠还显示出其他组织(包括肌肉、β细胞和骨骼)功能障碍，以及全身胰岛素抵抗。 但具体是哪些循环外泌体miRNAs参与了这些表型仍有待确定。

其他研究表明，来源于脂肪EVs的miRNAs也可以发挥旁分泌功能。从含有 miR-16、miR-27a、miR-146b和miR-222 的大脂肪细胞中释放的EVs可以转移到小脂肪细胞中，从而刺激其脂肪生成和脂肪细胞肥大。脂肪细胞分泌这些miRNAs是由游离脂肪酸和H 2 O 2 诱导的，在老年小鼠的血清中这些miRNAs表达上调。这些结果提示促进脂质积累和胰岛素抵抗的信号可能通过脂肪细胞的分泌miRNAs从胰岛素抵抗的脂肪细胞向新形成的脂肪细胞传播。肥胖患者的多种脂肪组织衍生的循环miRNAs(通过含脂肪特异性蛋白FABP4的细胞外颗粒的亲和纯化鉴定)在减肥手术一年后发生了显著变化。估计这些miRNAs可靶向WNT/β-catenin和胰岛素信号通路的成分。减肥手术后差异表达的miRNAs中， let-7a和miR-16 的靶标涉及胰岛素受体信号传导，并且这些miRNAs的水平与支链氨基酸（BCAA）的水平相关，表明它们可能与全身胰岛素抵抗相关。

胰岛细胞不仅可以通过分泌胰岛素和胰高血糖素来控制代谢，还可以通过分泌miRNAs来控制代谢。 初级胰岛细胞和β细胞来源的MIN6细胞在收到胰岛素分泌刺激时可释放特定的miRNAs。例如，与瘦组相比，肥胖ob/ob小鼠的血清、胰岛、肝脏和骨骼肌中 miR-223 表达上调。但其前体pri-miR-223仅在胰岛中升高，这表明其他组织中成熟miR-223水平升高来源与胰岛。miR-223已被证明能与 Glut4 mRNA的3' UTR结合，下调脂肪组织中的GLUT4( 葡萄糖的代谢取决于细胞对葡萄糖的摄取，然而，葡萄糖无法自由通过细胞膜脂质双层结构进入细胞，细胞对葡萄糖的摄入需要借助细胞膜上的葡萄糖转运蛋白（glucose　transporters）简称葡萄糖转运体（GLUT）的转运功能才能得以实现。GLUT4就是其中的一种形式 )，上调心肌细胞的GLUT4表达。

miR-155、miR-142-3p和miR-142-5p 可能从T淋巴细胞来源的EVs转移到β细胞，导致炎症通路、细胞凋亡的激活和胰岛素缺乏性糖尿病的发生。

人单核细胞在促炎刺激后分泌的EVs具有高水平的 miR-150 。用这些EVs孵育微血管内皮细胞可下调miR-150靶基因c-Myb，这是一种参与内皮细胞迁移的转录因子。miR-150在体外过表达可诱导内皮细胞迁移，这种作用可通过动脉粥样硬化患者（miR-150水平上调）血浆中的EVs孵育来模拟。来自血管平滑肌细胞的EVs已被证明能够促进 miR-155 向内皮细胞的转移，通过降低紧密连接蛋白的水平来影响内皮屏障的完整性。暴露于氧化的低密度脂蛋白（LDL）的内皮细胞分泌的EVs高表达miR-155，miR-155可以将巨噬细胞的极化从M2样表型转移到促炎性M1样表型。血清和心脏中 miR-126 水平的变化被认为通过影响MCP-1和VCAM-1的表达而在心功能障碍中发挥作用。这些过程改变内皮功能，促进动脉粥样硬化。

越来越多的证据表明，循环EVs可能穿过室管膜层和血脑屏障(BBB)作用于中枢神经系统，从而发挥组织间通讯的作用。老龄大鼠鼻腔给药含 miR-219 的血清EVs可增加中枢神经系统的髓磷脂含量。改变血脑屏障(BBB)通透性的神经退行性疾病可以促进大脑循环miRNAs与血液循环miRNAs的交换。也有证据表明 EVs可以通过胞吞机制穿过血脑屏障 。许多细胞外miRNAs被认为是神经退行性疾病的疾病生物标志物，尽管它们在这些疾病的病理生理学中的作用尚不确定。 衰老会影响下丘脑干细胞分泌EVs miRNAs，而脑室内注射下丘脑干细胞分泌产生的EVs能够延缓下丘脑衰老。（汤老师的Nature文章） 含有miRNAs的EVs也涉及神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞之间的相互作用。2018年，Huang等人发现脑损伤后小胶质细胞EVs 中miR-124水平升高，观察到这个miRNA可以转移到神经元中发挥抑制神经元炎症和促进神经元突触生长的作用。

尽管这个领域还很年轻，但细胞外miRNAs作为细胞间通讯的生理机制的概念却令人兴奋并受到关注，使用细胞外miRNAs更好地对疾病分期以及治疗的前景也是如此。目前，开发合适的工具和标准化的方法来评估miRNAs的运输和交付是该领域的瓶颈，但是在未来几年可能被克服。克服这些障碍将把这一领域带入一个新的高度：特定的细胞外miRNAs可被视为不同生理和病理生理状况的生物标志物，而外泌体或其他EVs中的miRNAs可被用于以一种特定而有效的方式治疗疾病。

感觉这篇综述的质量不如我写的上一篇 ChemicalReviews综述 ，那篇更全面，并且对某些方面描述也更具体。不过这篇也可以学到少量那篇综述没涵盖到的知识点。

原文链接： Cell Metabolism 30, October 1, 2019. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. IF: 22.415

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脂肪组织巨噬细胞来源的外泌体miRNA可在体内和体外调节胰岛素灵敏度

原文链接： Ying et al., 2017, Cell 171, 372–384. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.

这篇文章简单来讲讲的是： 驻留在脂肪组织中的巨噬细胞利用外泌体调节全身胰岛素反应。

文章亮点：

【摘要】

miRNA是一种调节分子，可以被包装在外泌体中从细胞中分泌出去。这里，我们展示了肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞分泌的含有miRNA的外泌体(Exos)给瘦小鼠使用时，可导致瘦小鼠发生葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。相反，从瘦老鼠身上获得的ATM Exos，注射给肥胖小鼠，可改善肥胖小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。 miR-155 是肥胖小鼠ATM Exos中高表达的miRNA之一，更早的研究表明PPAR 是miR-155的靶基因。我们的结果表明，与对照组相比，敲除miR-155的小鼠具有胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。此外，将野生型小鼠的骨髓移植到miR-155敲除小鼠中可以缓和这种表型。综上所述，我们的研究表明ATM Exos中含有miRNA。这些miRNAs可以通过旁分泌或内分泌调节机制被转移到胰岛素靶细胞，对细胞胰岛素反应、胰岛素敏感性和整体葡萄糖稳态具有强大的影响。

引言

胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要病因，肥胖人类胰岛素抵抗最常见的原因。由于全球肥胖率的持续上升，2型糖尿病的患病率也随之上升。人类和啮齿类动物肥胖的特征之一是脂肪组织、肝脏、可能还有骨骼肌的慢性未解决的炎症。这种由肥胖引起的组织炎症反应其中一个引人注目的组成部分是促炎巨噬细胞的积聚，尤其是在脂肪组织和肝脏中。许多早期的研究检测了这种慢性组织炎症状态，并提出促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF-a)，是由组织巨噬细胞分泌的，可直接抑制胰岛素敏感性，是肥胖诱导的胰岛素抵抗的一个潜在病因。然而，抗TNF-a抗体在人类胰岛素抵抗和葡萄糖代谢方面的治疗疗效不显著，提示有其他巨噬细胞分泌因子和免疫细胞因子参与了胰岛素抵抗。最近，花生四烯酸衍生的二十碳三烯白三烯B4通过其特异性受体BLT1发挥作用，被认为是直接降低肝细胞和肌细胞胰岛素信号通路的因素之一。Galectin-3是另一种巨噬细胞分泌因子，既可促进促炎反应，又可通过抑制胰岛素受体信号通路直接阻断胰岛素作用。在这篇文章中，我们报道了ATMs通过分泌含有miRNA的Exos进入循环系统来调节胰岛素作用的新机制。

miRNA与mRNA的结合导致靶mRNA被募集到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，从而导致转录停滞和mRNA的降解。除了这种本身的细胞内作用，miRNA可以以外泌体内含物的形式被细胞分泌出去，既可以在局部发挥作用，也可以进入血液循环，在远端发挥作用。也有证据表明，这些Exos可以被运输到邻近或遥远的受体细胞，调节受体细胞的功能。这些现象导致我们假设ATMs可分泌外泌体miRNA，作为细胞外分子调节细胞胰岛素作用和系统胰岛素敏感性。

结果

1. ATMs分泌外泌体miRNA

文章第一步先确定ATMs可以分泌包含miRNA的外泌体。

2. 从肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos促进胰岛素抵抗

从肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos会损害三种主要胰岛素靶组织的胰岛素敏感性。

3. 肥胖小鼠ATM-Exosomal miRNAs损害细胞的胰岛素敏感性

肥胖ATM-Exos在体内的作用显著，我们同时对脂肪细胞、肌细胞和肝细胞的进行了相应的体外研究。

4. 来自瘦小鼠的ATM-Exos会降低肥胖引起的胰岛素抵抗

从反面去验证上面实验得到的结果。

5. 肥胖诱导ATM-Exo中miRNA的表达变化

现在开始做机制。

6. MiR-155损害细胞胰岛素信号通路

上一个结果中列举了MiR-155表达的趋势，现在开始做表达差异的功能。

7. ATM-Exo miR-155促进肥胖诱导的胰岛素抵抗

miR-155抑制细胞胰岛素信号转导。

这篇文章先是确定了表型：ATMs可以分泌外泌体，这些外泌体会与胰岛素抵抗相关，胖ATM-Exo会促进胰岛素抵抗，瘦ATM-Exo可以降低肥胖引起的胰岛素抵抗。

然后去探讨为何ATM-Exo可以发挥这样的作用。发现ATM-Exo包含miRNA，瘦ATM-Exo与胖ATM-Exo中miRNA的表达差异显著，肥ATM-Exos中miR-155的丰度明显高于瘦ATM-Exos。选择这个miRNA主要是根据研究经验（也有可能是课题组刚好有这种转基因小鼠）。然后选了miR-155众多靶基因中的一个和胰岛素信号通路相关的靶基因PPAR ，同理选了GLUT4。

最后从正、反、在体、离体等多个角度去show了一些支持猜想的结果。

这篇文章思路简洁，逻辑连贯，但是在过渡到选择靶分子的这一步没有必须性。按照这个差异表达结果其实可以选择那些差异表达的另外某个miRNA去做，说不定也可以做出来相似的结果。

这篇文章的方法部分可以借鉴一些ATMs分离，外泌体分离提纯的方法，还有transwell共培养，骨髓移植等技术之前没接触过，需要按需学习。

原文链接： Ying et al., 2017, Cell 171, 372–384. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.

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