同一个样品外泌体测序（外泌体测序测哪些）

本文目录一览：

• 1、什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？
• 2、外泌体提取策略
• 3、什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍
• 4、外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论
• 5、外泌体多组学02-体液来源外泌体的组织和细胞类型溯源

什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？

外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。

目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。

由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。 

什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍

外泌体的实验的基础，很多童靴认为这是最简单的。如果你真的这么认为，那么就大错特错了。收集样本有不同的要求，一个比一个重要。那该如何去选择我们的实验样本？取样的时候又该注意些什么？分离好后的外泌体又如何保存呢？

一、外泌体样本的选择和注意事项

实验样本不同在收集的时候需要注意的点不同。你研究的是哪种样本，需要特别注意哪些方面呢？看以下阐述：

1、细胞上清

选用细胞培养上清作为分离外泌体的实验材料不会像血样等存在样本量限制的问题，而且操作简单，直接离心即可。但在细胞培养过程中需注意污染、培养时间、细胞死亡率及FBS的问题。和所有的细胞实验一样，培养过程中不允许有污染，但有些培养细胞本身带有病毒基因组，在培养过程中会释放出病毒颗粒，这就要衡量病毒颗粒是否会影响后续实验。

一般培养24-48h后细胞即可分离外泌体，在特殊情况下，如在培养基中添加特殊的化学物质，培养15-60min即可收集。因细胞死亡会分泌小体，所以在研究外泌体时细胞的死亡率一定要控制 5% 之内。未经处理的FBS中含有大量的外源外泌体，所以细胞培养一定要用经过处理不含外泌体的FBS。

2、唾液

唾液的成分会因取样的位置和时间不同而不同，所以同血样一样需定点定时。唾液主要由舌下腺，颌下腺及腮腺3个腺体分泌，所以不同位置的唾液成分不同，在收集的时候需固定位置或是收集所有的唾液。不同时间段的唾液成分也会不一样，所以也需定时取。其他如吸烟进食都是禁止的，一般建议采样1h之内不能有进食行为，包括饮料，且不要剧烈运动，在平息状态下取样。最后一点，不能刷牙。

3、血液

在第一次外泌体课程的时候，就有许多同学问到关于血清和血浆选择的问题，那到底应该选哪个呢?血浆=血液-血细胞 血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子

分不清楚两者的弄清血清的来源就能牢牢记住啦。血清是血液凝固之后收集的液体，所以其中少了纤维蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体，有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。所以一般实验选择血浆，在特殊情况下，如研究与血小板相关的疾病的时候，当然是血清更适合。

受限于样本，血样一般取2ml。那取血样的时候有什么注意的地方呢？在外泌体的血样研究中，经常被忽略的一个问题就是针头的大小。在抽血过程中，血液流经针头的时候会产生剪切力，若针头太细，剪切力较大，会使细胞破碎或刺激血小板分泌外泌体，从而影响后续的实验。有些文献报道21号针头的大小比较合适作为外泌体研究的血样收集。其他诸如采血的位置，人的生理周期，饮食周期及时间周期（24h）等都会影响样品中的外泌体。所以取样的时候尽量定点定时。最后还需注意，尽量在采血30min内处理样本，因血液收集在收集管中时，血细胞和血小板还会分泌外泌体。

4、鼻涕

研究鼻涕有一个特殊的价值，其可以探索治疗性外泌体。啥是治疗性外泌体？在脑部的疾病治疗中，药物可以外泌体的方式注射到鼻腔，这样药物就可以避开血脑屏障。鼻涕的收集与许多环境因素相关，如年龄、季节、性别 、城市、过敏史及职业风险。鼻涕的收集方法没有统一标准，只需保证所有样本取样方法一致即可。

5、尿液

在尿液的取样中，除性别、年龄、进食等影响外，还有一个特殊的点即是尿液的新鲜程度，这个新鲜度指的是尿液在膀胱中存在的时间。

6、乳汁

乳汁中存在的外泌体、抗体等会影响新生儿的发育，具有较大的研究价值。泌乳的阶段、 胎次、膳食、泌乳量、是否是母乳喂养、母亲的健康状态、精神状态等都会影响外泌体的分泌。需要注意的是乳汁中含有大量的脂蛋白，会对后面分离外泌体产生影响。

7、脑脊液

脑脊液研究面临的困难主要在样本的获取及样本中外泌体丰度少，有木有一种雪上加霜的感觉。那这个问题如何解决？国外可购买商业正常样本或者使用其他疾病样本作为对照。

二、外泌体的保存

对于外泌体的保存，和其他分子样品一样，提取的外泌体低温保存即可，短时间（一周之内）可放4度，长时间放-20或-80。也有人认为放4度更好，怕低温冻融会影响外泌体的完整性，但目前还没有一个定论，而且大部分文献认为没有影响。那到底放几度呢？有一招，分装放-20或-80，是不是妥妥的。

外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论

外泌体和微囊泡是几乎所有类型的细胞都能释放的细胞外囊泡(ev)的两大类，在生物液体中非常丰富，ev的分子组成和释放都被认为是受到外界刺激的严格调控的。多项研究一致表明，ev可以在不同的细胞类型之间转移蛋白质、脂质和RNA，从而介导细胞间的通信和信号转导。重要的是，ev中的小非编码rna被认为是在受体细胞中发生的分子事件的主要贡献者。

此外，外泌体和微囊泡中的RNA可以作为多种疾病的非侵入性的生物标志物，包括免疫系统的病理变化。

这篇综述旨在提供ev相关RNA转录组领域的最新技术，以及对以往使NGS测序来描述不同细胞释放的ev中RNA含量的研究进行全面分析。最后，我们强调了与获得纯EV和 EV相关RNA的深度测序 相关的技术挑战。

细胞外囊泡分为三种类型（ classifified by their origin and biogenesis）：apoptotic bodies (ABs), microvesicles (MVs, also known as shedding vesicles), and exosomes。

大肿瘤小体(LOs)已被确定为第四种类型的ev，它是由肿瘤细胞脱落的膜泡产生的，其大小与 ABs相似。

它们直径大小不一，包含物也有所差异：MVs和外泌体包含各种细胞质和膜解蛋白以及脂质、糖和核酸（9），而ABs可能还包括核组分和细胞器。

marker特征差异：外泌体特征良好的蛋白标记物包括各种四酯蛋白，如CD9、CD63和CD81；而mv包含质膜常见的跨膜蛋白，如整合素和选择素；同时，ab可以通过组蛋白的存在来区分。

在多种早期RT-qPCR技术以及最近的报道中，外泌体和MV中的mRNA、miRNAs和lncRNAs得到了一致的证实。更先进的高通量RNA测序方法的应用揭示了，从生物液体和细胞条件培养基中分离的ev亚群中存在各种其他RNA种类。

这些RNA种类包括snRNA、snoRNA、piRNA、vault RNA、Y-RNA、scRNA、SRP-RNA和7SK-RNA；以及来自rRNA、tRNA、mRNA、lncRNA和各种基因间重复序列的短片段。

TABLE 1 | 使用高通量测序显示EV转录组含量的报告

Nolte-‘tHoen等人通过高通量测序研究了培养过程中免疫细胞释放的EV中的小RNA含量。从EV中分离出的总RNA大部分是小RNA (200 nt)，含有少量的18S和28SrRNA。这些短RNA片段主要定位于蛋白质编码区和基因组重复序列，包括SINE、LINE和LTR序列。相反，细胞小RNA群体中存在的大部分序列代表miRNAs，而细胞分泌的EV中miRNAs的比例显著较低。

除了编码mRNA和重复序列的蛋白质外，EV组分还包含所有类型的结构RNA(如vaultRNA、Y-RNA、snRNA、snoRNA、SRP-RNA和tRNA)以及来自lncRNA和假基因的片段。

此外，相对于细胞RNA来说，许多小非编码转录本在EVs中富集，这表明细胞可能选择特定RNA进行细胞外释放。

许多其他研究也证实，由各种培养细胞释放的外泌体中，miRNA 的表达明显低于其他种类的 RNA，这些数据与先前的观察结果一致，即大多数个体外泌体不携带任何生物学上有意义的 miRNA 拷贝。然而，其他的 RNA 测序实验表明，一些细胞系释放的外泌体中相当大比例的小 RNA-seq reads仍然与 miRNA 相对应。

有趣的是，几个独立的小组观察到有15-50% total reads RNA 片段比对到包括逆转录病毒序列，LTR，SINE，和 LINE 序列的基因组重复序列。需要指出的是，作者并没有明确说明在上述研究中使用的小 RNA 文库制备方案是否包括允许捕获5′-OH 和/或3′-磷酸化 RNA 的修饰。因此，目前尚不清楚他们是否真的在相应ev中表征了小RNA的全谱特征。

Jenjaroenpun 等人和 Miranda 等人分别报道了在 MDA-MB 细胞培养液和尿液 EVs 中总 rna (包括长 rna 和小 rna)的测序，并显示了相当比例的 rRNA 读数(87-97%) ，与细胞质中的 rRNA 含量相似。在剩下的3-13% 的片段中，大约一半被标记为蛋白质编码转录本，另一半则标记为非编码 rna 和基因组重复序列。

在Beradrocco等人的另一篇报道中，作者分别使用total RNA和sRNA测序protocols来表征四种不同肝癌细胞系释放的EV中封装的长RNA谱。总RNA片段比对到rRNA的比例最大(32-66%)，而基因组重复序列的比例为15-44%，只有11 -25%的片段映射到蛋白编码和非编码RNA基因。对相同EV制剂进行的sRNA测序显示，RNA类别的分布略有不同:rRNA(16-54%)、基因组重复序列(24-40%)和转录组(24-51%)。

在另一项与small RNA测序相平行的全转录组RNA-seq研究中，Lasser等人证实，人类mast和红白血病细胞系释放两个外泌体群体(通过密度梯度浮选分离为HD和LD组分。在HD和LD部分中，长和短RNA cargo明显缺乏相关性，这表明这两个部分的细胞外RNA与不同的通路相关。与LD外泌体相比，HD中mRNA转录本的reads比例更丰富(75 vs. 20%)，而非编码RNA的分布则相反(25 vs. 80%)。 在 short RNA libraries，HD部分富集成熟miRNA(23%)，而LD部分主要是tRNA(28%)和成熟miRNA(10%)。

另一项研究研究了黑色素瘤细胞在培养过程中释放的三种不同EV类型的RNA含量，并确定了一些非编码RNA在每个EV样本中富集。RNA图谱表明，在相对中等水平的sRNA水平的ABs和MV中存在显著的18S和28S rRNA峰。相比之下，外泌体主要包含小RNA，与ABs和mv相比rRNA更少。尽管EV亚群的miRNA装载量与外泌体略有不同，但大量的miRNA仅在外泌体中被检测到，而在ABs和MV中均不存在，这支持了外泌体富集特异RNA的概念。必须指出的是，与miRNA相比，其他ncRNA种类不仅显著丰富，而且选择性富集在黑素瘤细胞释放的不同EV亚型，这增加了研究细胞外囊泡RNA货物及其功能的复杂性。

到目前为止，只有少数报道对从人类生物液体中分离的EV中的小RNA货物进行了下一代测序。这些研究表明，从人血浆、唾液和尿液中分离出的外泌体含有相当比例的miRNA reads(35-76%)。

上述生物流体EV中其余的RNA种类包括rRNA、lncRNA、tRNA、mRNA、重复区域以及小的非编码RNA如piRNA、snRNA、snoRNA等。值得一提的是，与“几天”细胞条件培养基相比，从生物体液中分离出的外泌体可能含有大量的大蛋白聚集物，包括通常在细胞死亡时释放的装载mirna的AGO复合体。因此，在人类体液中检测到的miRNAs是否确实与ev相关仍有待验证。

有趣的是，对尿液外泌体纯化的总RNA进行深度测序发现，其转录本分布与Cheng等人(48)观察到的完全不同。具体来说，大部分(约87%)的RNA reads被映射到rRNA上，只有约8%的reads被映射到非编码RNA和DNA重复序列上，而剩下的约5%对应于蛋白质编码RNA。相反，Miranda等报道的图谱统计和reads分布与细胞条件培养基中外泌体的总RNA测序结果相似。

综上所述，从上述研究演变而来的集体证据(表1)认为，大多数细胞释放的EV确实携带大量的非编码转录本和蛋白质编码转录本，以及它们的部分，在研究细胞外RNA对受体细胞的影响时应该考虑这些。

EVs RNA载物含量的差异可能部分是因为:

外泌体多组学02-体液来源外泌体的组织和细胞类型溯源

外泌体(30~150nm大小)是活细胞分泌的最小类型的细胞外囊泡(为30~1000nm)，通过所有体液的循环系统，如血液、尿液和眼泪，作为细胞间的信使。体液外泌体的来源混杂，可以是任何组织和细胞分泌的外泌体然后经体液循环进入。

其中，尿外泌体可以反映病理生理学，并为肾相关功能障碍提供生物学理解，是泌尿系统癌症很有前途的生物标志物来源。

尿外泌体和泌尿/非泌尿器官或细胞之间的遗传网络仍不清楚，本文旨在对尿外泌体bulk RNA-Seq数据进行组织和细胞类型溯源，为外泌体应用于疾病诊断和治疗提供重要理论依据。

本次介绍的文献信息如下：

在我们的体液中，纳米级细胞外囊泡的遗传起源尚不清楚。在这里，我们通过RNA测序对尿外泌体进行了跟踪分析，发现尿外泌体主要表达膀胱的组织特异性基因，并与内皮细胞、基底细胞、单核细胞和树突状细胞有密切的细胞遗传关系。对癌症的差异表达基因进行追踪和相应的富集分析显示，尿外泌体密切参与免疫活动，这表明它们可以作为癌症基因组诊断和精确医学中非侵入性液体活检的可靠生物标志物。

数据情况：

ssGSEA：观察到肾和胃的TSG在膀胱癌和对照样本中有差异表达(图1B)；相比之下，膀胱、肺、脑和肝脏的TSG在肾癌样本及其对照组中存在差异表达Fig. 1C。

细胞类型signature matrix：

来自于 HCL，human cell landscape (HCL, )的单细胞数据和markers，主要包括肾脏的16种细胞类型与膀胱的16种细胞类型

CIBERSORT：构建了一个细胞类型矩阵，并研究了外泌体的细胞水平来源(Fig. 1D)：

bulk RNA-seq分析通常通过识别DEGs来比较不同条件下的转录本丰度。当整个组织的RNA-seq(bulk RNA-seq)完成时，确定基因表达的变化 在多大程度上是由于细胞类型比例的变化 通常是一个挑战。而这一挑战可以通过单细胞RNA-seq(scRNA-seq)方法来解决。bulk RNA-seq通过去卷积分析，可以估计细胞类型比例的变化。

下面这张图展示了 细胞类型的特异性和细胞类型的比例如何导致基因差异表达(DEG) ：

在上图中，形状表示细胞类型，每个形状的数量表示相对的细胞类型比例。颜色代差异分组。点代表每个细胞内基因表达水平。

使用了一个工具scMappR：分配贡献DEG的细胞类型，并确定了cwFoldChange最高的细胞类型

肾癌标志物中的S100A10和CCAR1，膀胱癌标志物中的CD248和MT-ATP已被证明在尿癌中具有促进肿瘤的功能

意外发现：DDX17的表达水平呈明显的变化趋势：肌肉浸润性膀胱癌 非肌肉浸润性膀胱癌 DDX17表达，这可能是由于人类RNA解旋酶DDX17通过调节几种DNA和染色质结合因子的选择性剪接来促进肿瘤细胞的侵袭性

各组的基因组合可以提高肿瘤样本与相关良性疾病样本的准确性，对这两种尿路癌的早期诊断具有指导意义

主要结果：

研究意义：

文献中使用的软件 scMappR 利用单细胞数据构建signature matrix来对bulk RNA-Seq进行去卷积分析，我们下期介绍~~~