细胞免疫荧光实验视频（荧光免疫实验报告）

本文目录一览：

• 1、细胞免疫荧光，可不可以在24孔板直接做，不用爬片
• 2、细胞爬片免疫荧光实验具体操作步骤是什么?
• 3、细胞免疫荧光，求助

细胞免疫荧光，可不可以在24孔板直接做，不用爬片

可以在24孔里做，问题是观察不方便 除非用倒置激光共聚焦显微镜。

一般只有在做活细胞实验时候才会在多孔板内进行。

细胞爬片免疫荧光实验具体操作步骤是什么?

单位实验室做过，小编顺便推荐一下细胞爬片是从上海晶安生物公司买的，实验效果不错.

细胞爬片免疫荧光步骤：

1.晶安生物细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子

具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；

3.PBS漂洗5min；

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；

5.PBS漂洗2次，每次5min；

6.1%BSA封闭30min；

7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；

8.PBS漂洗2次，每次5min；

9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；

10.PBS漂洗2次，每次5min；

11.5ug/ml DAPI染色2min；

12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:

2.5% DABCO (w/v)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

细胞免疫荧光，求助

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。实验步骤如下：

1、已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

2、 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。

3、吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。

4、0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

5、与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。

6、 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。

7、加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。

次日：

8、取出细胞复温至室温约1h。

9、冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

10、配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(HL) TRITC，用PBS或FBS配制。浓度1:200

11、加入二抗，室温孵育1小时(避光)。

12、 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

13、DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。

14、 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

15、加入防荧光淬灭封片剂，避光。

16、上机confocol

建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。