阿尔汉娜外泌体是什么提取的（外泌体提取）

2023-01-01 03:57:46 作者：max

本文目录一览：

1、什么是阿尔汉娜外泌体
2、cpe外泌体和普通细胞中外泌体的区别是什么？
3、外泌体提取策略
4、如何从尿液中快速、大量提取高质量、高纯度的外泌体？

什么是阿尔汉娜外泌体

不知道大家还记不记得在2017年由冯小刚执导《芳华》电影，相信看完这部的人都会感慨人性本初的善良，同时也会追忆着自己的青春岁月，就正如电影结尾旁白萧穗子说的那样：“一代人的芳华已逝，面目全非，虽说他们依旧会谈笑如故，可还是能看得出岁月给每个人带来的改变，原谅我不想让你们看见我老去的样子”。

的确，我们每个人都会老去，同样外在的芳华面容和内在的心灵也会随着时间褪去，在这场岁月“战役”面前，没有谁能一直成为那个“赢家”，随着时间的推移会带走许多东西，而外在的芳华面貌是最直观的。衰老是我们人生中最大的敌人，虽说人的衰老是不可逆的，但我们可以让它到来的脚步能慢一些。今天小编就和大家聊一聊很多每一位女性都关注的抗衰老话题。

首先皮肤是怎么衰老的？

其实关于人体衰老的机理在国内外都已经做了大量的研究，且还提出了两百多种的衰老学说，这其中最具代表的有生物钟学说、细胞凋亡学说、代谢失衡学、糖基化衰老学说和光老化学说等等。这些学说之间可以说是存在着内在的联系并互为因果，因为都可以用实验方法去证实，但同时也没有哪一种学说能够非常完整去阐明人体衰老机理。不过衰老学说总的来说是可以分为两大类：一是内在因素、二则是外在因素。

1、内在因素

我们皮肤衰老的内在因素有一部分是和基因遗传有直接的关系，这是每一个人都无法去避免的，就像有些人天生皮肤就非常的好，平时就算是不怎么去护肤甚至是随意造作都不会影响她的皮肤状态，这就是依靠天生的基因决定的，对于我们大部分人是没有那么幸运有这种基因的。

而另外一部分因素就是遵循自身身体的选择了，因为随着年龄的增长身体供给皮肤的营养会逐渐减少，一旦皮肤的营养跟不上就会导致表皮层变薄，再加上人体的新陈代谢变慢就会导致表皮的更新时间也拉长、皮肤角质的代谢速度变慢以及屏障功能受损等，而皮肤的屏障功能受到损伤后，一些常见的皮肤问题就会如约而至，如皮肤敏感、干燥和刺痛等问题，如果这时候没有进行及时的护理就会一步步加速皮肤的衰老。

2、外在因素

导致皮肤衰老的外在因素有很多种，不过首当其冲的还是紫外线的照射，相信大家都听说过皮肤光老化，其实就是皮肤在紫外线的影响下由外到里的受损过程，而且阳光中的UVB会让我们皮肤的表皮受损，进而出现晒红、晒伤的情况。不过最重要的还是阳光中的UVA，因为如果你不做好防晒的工作它能够直达肌肤的真皮层去破坏弹性纤维和胶原蛋白纤维，并且进一步加速胶原蛋白的分解，最终加速我们皮肤的老化。

还有的就是空气污染、环境污染、生活习惯等因素都会影响到皮肤，对于这一些外在的因素最好是做足预防措施。所以我们肌肤的衰老程度既有内在由基因决定的自然衰老，同样也有外在由于环境和生活习惯给肌肤带来的压力和挑战，而内外因素是不能相互独立的，更多的是相互影响。其实我们人体的衰老机理是非常复杂的，现在还有很多国内外的科学家还在探索和研究阶段，而目前市面山那些抗衰老产品主要是针对引起肌肤老化的某个点或者是某几个点来采取措施。如抗氧化、抗糖化、防晒和刺激胶原蛋白再生等都属于抗衰老的范畴，所有防止肌肤老化、改善松弛、下垂和祛皱的产品也都可以称为抗衰老，还有抗衰老还包含了肌肤老化的各个年龄阶段。

为什么抗衰需要外泌体？

有一句话说得好：冰冻三尺非一日之寒，滴水石穿非一日之功。这句话用在皮肤衰老上也是同样适用的。世界卫生组织说：我们人皮肤衰老的本质实则就是细胞的衰老。换句话说就是所有的皮肤问题最终都会归咎到细胞上，在这里就拿皮肤的细胞举个栗子：如果一个人的皮肤肤细胞出现了问题那么就很容易出现这几种情况，一是皮肤的炎症问题会直接导致细胞间的通讯中断，这样一来会让皮肤的自我调节功能无法正常工作，第二是细胞一旦受到损坏是会使得细胞的新陈代谢出现问题，要是细胞的生命周期变短会使得细胞分裂更新速度变得非常缓慢，如此一来随着人的年龄增长胞也会慢慢的“集体衰老”，要是衰老细胞长时间累积起来甚至会出现肌肤暗黄、干燥、长皱纹以及细纹等皮肤问题。

而外泌体是可以直接调控细胞的，这就好鄙视拿到了能够直接影响细胞的关键钥匙，它会像一个小精灵那样利用细胞记忆去智能调控肌肤修复方向，并且激活自体细胞再生力以及加强皮肤新陈代谢能力。另外外泌体作为细胞护肤的主要成分还能对多种细胞生理功能和代谢功能都能发挥生物调节作用，然后直接或者间接去影响多种类型的细胞的生长、分裂、分化、扩增和迁移等工作。对于那些已经受损的细胞或者是已经失去活性的细胞也会一一进行修复和唤醒工作和重建细胞屏障、激活皮肤细胞分化以及促进再生从源头上实现抗衰。

cpe外泌体和普通细胞中外泌体的区别是什么？

cpe外泌体的提取技术采用了无血清培养基技术，这一技术能够排除血清中本身存在的外泌体，因为cpe外泌体是从动物脐带精华中提取出来的，而血清中的外泌体完全无动物源性，所以能够保证提取出来的成分纯净度，另外不仅能提高细胞释放外泌体的数量，还可以保证外泌体中营养因子的huo性哦。

阿尔汉娜外泌体是什么提取的（外泌体提取）

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从上清液中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1 聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加缓冲液冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5 ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体活检中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。