外泌体粒径分析图（外泌体形状）

本文目录一览：

• 1、再生医学材料的黄金搭档：外泌体与细胞外基质
• 2、什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？
• 3、外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论
• 4、细胞外泌体是什么？

再生医学材料的黄金搭档：外泌体与细胞外基质

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外泌体的概念

上世纪80年代，外泌体首次被科学家发现，并且在很长时间内被认为是细胞的代谢产物。由于当时分析和研究的手段受限，外泌体的功能并不明晰。直到21世纪，科学家们才通过各种新技术，分离和提取出外泌体，并发现 外泌体在细胞之间充当重要的沟通介质，进而影响细胞而至组织的生理活动。

细胞可以通过分泌细胞外囊泡与临近细胞或者远端细胞进行通信，而外泌体正是其中一类尺寸小于200纳米的细胞外囊泡。外泌体是在多泡核内体或多泡体中产生的，并在这些囊泡与质膜融合时分泌。外泌体由与细胞类似的磷脂双分子层组成，该双分子层含有跨膜蛋白和胞质蛋白和RNA；外泌体的内部包含一系列蛋白质 （胞质、骨架和生长因子） 和传递特定功能线索的miRNAs。因此，外泌体可以通过其表面的磷脂双分子层上蛋白靶向到受体细胞。外泌体一旦附着在靶细胞上，可通过受体-配体相互作用诱导信号转导，或通过内吞和/或吞噬作用内化，甚至与靶细胞的细胞膜融合，将其内容物传递到靶细胞的胞质中，从而改变受体细胞的生理状态。外泌体具有良好的生物相容性，不易在机体内引发免疫排斥反应。

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外泌体的提取

所有的细胞都可以分泌外泌体，机体的体液内和间质中均含有大量的外泌体。由于生物体内所含有的细胞或者蛋白非常丰富，因此从体内提取外泌体是非常困难的，而且外泌体来源的细胞也无法确定。

现如今有两类广泛使用的用于提纯外泌体的方法：超速离心法和Thermo Fisher等公司生产的提纯试剂盒。

超速离心法，主要是通过将实验室培养干细胞所得到的培养基通过滤膜滤掉尺寸较大的细胞碎片及细胞外囊泡后，通过超速离心机在100,000g的离心力的作用下富集得到外泌体。

提纯试剂盒，主要是通过试剂包被外泌体，使其尺寸和重量增大，从而在10,000g的离心力即可得到外泌体。试剂盒的使用有导致外泌体污染的风险，在科研领域超速离心法更为常见。

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外泌体的生物学特性

由于外泌体在再生医美领域显示出极大前景，这也迎来产业化合作的新浪潮，眼下外泌体似乎已经成为下一个生物医药的黄金赛道。科学家们普遍认为， 外泌体具有其独特的生物学特征，可以反映来源细胞的表型 。

图 5 外泌体促进皮肤修复

不同细胞分泌不同的外泌体，因此外泌体的应用是多种多样的。一方面， 外泌体被认为是多种癌症的疾病诊断生物标志物。 外泌体独特的miRNA谱图和疾病载体作用，使得其频繁出现在卵巢癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和结肠癌。另一方面， 外泌体也可以作为细胞信号传导的有效媒介而广泛用于医学再生领域。 例如，它们能够将RNA和蛋白质的信息从来源细胞转移到周围环境中的其他细胞。实验证明，来自小鼠胚胎干细胞的外泌体在体外促进了小鼠造血干细胞的存活和扩展，同时也上调了受体细胞中与多能性相关的转录因子。干细胞来源的外泌体与生物材料相结合，促进骨组织以及关节软骨的修复和再生。

在皮肤组织再生中，外泌体的应用尤其广泛。 如脂肪源外泌体能通过减少IFN-α的分泌而发挥免疫抑制作用，从而抑制T细胞的激活。此外，外泌体含有免疫调节蛋白如TNF-α、巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF） ，从而通过良好的炎症调节保证了伤口愈合。而在皮肤愈合过程中，外泌体则能通过优化成纤维细胞特性加速皮肤伤口愈合。在一项研究中发现，外泌体上调199个miRNA，下调93个miRNA，促进真皮成纤维细胞增殖和分化，加速皮肤再生。

图 6 外泌体促进皮肤细胞增殖

总而言之，干细胞来源的外泌体作用广泛。 在皮肤再生中，外泌体可以通过调控炎症、促进皮肤修复等多方面提供作用；在疾病发展中，外泌体也参与多种病理通路。 在未来，无论是组织再生、皮肤修复、还是疾病研究，外泌体都将在其中扮演重要角色。

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外泌体的缺陷

外泌体具有诸多优点，在医用再生中具有难以忽视的价值。然而，外泌体的应用却还有所局限。

最适用于提纯外泌体的超速离心法，在提纯得到外泌体的过程中会导致大量的外泌体损失，至少80%的外泌体会因为收集的损失或者在超离过程中其独特的磷脂双分子层的膜破碎而无法维持其正常形态。

此外，外泌体在提纯后其保存比较困难，需要保存的试剂具有与体液类似的渗透压从而维持其磷脂双分子层的膜结构，否则其内含的具有生物功能的蛋白质和miRNAs也容易失去活性。另外，外泌体起到信号传导作用，但本身并不会提供结构支持。因此，在修复领域，外泌体难以单独使用。

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细胞外基质：外泌体的最佳搭档

所有细胞均可分泌外泌体，外泌体充当着细胞之间信息交流的介质，因此外泌体生理功能的实现是通过一个细胞“出”而“进”入到另一个细胞内。在组织内部，必然要穿越细胞外基质。

因此，外泌体更适合作为细胞外基质的一部分来发挥价值，而细胞外基质的独特生理结构和生理稳态一来可以帮助维持外泌体的活性、二来也能与外泌体协同作用，实现更好的修复和再生效果。

细胞外基质是外泌体最理想的载体

在医用再生领域，科学家们研究各种各样的生物材料，并与外泌体进行复合促进组织的修复和新生。细胞外基质无疑是最安全的并且可以与外泌体协同发挥作用的生物材料。细胞外基质本身即源于人体，具有多元的组成 （胶原蛋白、弹性蛋白、层黏连蛋白等等） 。

一方面， 细胞外基质能够起到结构支持作用，作为承载材料提供组织再生的根基 ；另一方面， 细胞外基质中复杂的结构和靶点可以维持外泌体的活性，从而高效发挥外泌体的性能 。外泌体可以通过进入细胞内发挥其优异的生物学功能， 而细胞外基质作为载体即可以为细胞的黏附和迁移提供平台。如果没有细胞外基质所提供的平台，那么外泌体会很快随着体内的生理循环和代谢而流失，从而失去了其作用效果。众所周知，外泌体价格昂贵。 当外泌体由细胞外基质承载、由细胞外基质保护时，才会更好地提高其生物利用度 ，取得更好的修复效果。

细胞外基质提供适应的修复微环境

组织修复和再生，与细胞微环境息息相关。简单来说，微环境由两个基本组成部分组成，一个是细胞外基质 （ECM） ，而另一个是细胞分泌的外泌体、生长因子等功能性物质。二者缺一不可，彼此相辅相成、紧密结合。因此，光有外泌体，没有细胞外基质是远远不行的。

其实，除去细胞外基质 对外泌体的负载和保护作用，其本身也具备出众的再生和修复能力 。除了提供细胞存在的平台，细胞外基质的多元组成既可以为细胞的生理活动提供养分，并驻留在原位，成为机体自身的细胞外基质的一部分；又能够通过其本身的生物学特性来协同外泌体，实现更好的修复和再生效果。在经典的修复再生过程中，细胞外基质可以调节干细胞的表型和表达，而外泌体则含有控制干细胞分化的表型特异性指导因子 （miRNA，RNA和蛋白质）。

简而言之， 细胞外基质可以从拓扑结构、生物力学、功能靶点等多个维度与外泌体、生物因子共同作用，从而形成适于组织修复的胞外微环境。

首先，细胞外基质所含有的多种蛋白、多糖成分构建出其独特的三维结构和表面拓扑学特征。除支撑组织的生理形态外，还能够调控募集细胞的黏附、增殖和分化行为。近年来，人们更是发现细胞外基质构建的拓扑学结构与免疫细胞的免疫应答等行为息息相关，进而调控组织再生。

再者， 细胞外基质本身具有其独特的生物力学性质 。不同弹性模量、不同硬度的基质，能够引发细胞的不同表现行为和分化方向，也会引起细胞分泌和募集因子的不同。

细胞外基质极为多元的组成能提供不同的生物学效果，从而建立修复微环境 。举例来说，细胞外基质中的纤连蛋白因可与细胞表面的整合素蛋白的α5β1结合，充当修复过程中细胞与细胞外基质交流沟通的重要参与者，并且调控细胞的黏附、增殖、形态和分化等行为；蛋白聚糖通过参与调节细胞外基质的组装和维持，并通过与生长因子的相互作用参与细胞增殖等细胞行为，在组织的生理和生物力学功能中发挥重要作用。正是由于细胞外基质打下的坚实基础，才能让外泌体、细胞因子等活性成分进一步“锦上添花”。

另外，近几年研究中还发现，细胞外基质的结构能结合和锚定多种生长因子（如VEGF，HGF等）、多肽短链。一方面， 通过构型调整来更好地发挥其生物活性 ；另一方面，则能 形成生长因子梯度，从而介导修复和再生过程的进行 。可以想象，这是唯有细胞外基质才能实现的高度复杂而有序的生物过程。相比之下，仅仅使用外泌体完全无法实现上述空间上的介导过程。这也解释了为何直接使用外泌体或生长因子时，往往修复和再生效果并不如人所愿。

关于细胞外基质和外泌体之间的作用，目前依然还在不断研究中。然而，我们已经可以知道的是： 细胞外基质是组织再生的舞台，而外泌体则是舞台上的演员 。 演员可以让舞台更加 熠熠生辉 ， 但舞台却是整个根基所在 。 二者有机结合，则能带来最好的演出效果。

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细胞外基质/外泌体组合的应用

目前，细胞外基质/外泌体这一组合有了不少应用实例，其作用效果极为明显。

国外的研究中， 以细胞外基质中的胶原为支架组成并负载外泌体。 这一体系增加了外泌体在体内的保留时间、延长了释放过程，同时也在心脏组织的修复中取得了更好的效果。无独有偶，在另一项研究中，科学家则利用了仿细胞外基质的丝蛋白/壳聚糖复合体系，并通过慢性糖尿病患者皮肤创面愈合模型来考察了作用效果。可以发现， 这一仿细胞外基质和外泌体体系具有协同作用，能加速皮肤创面再生。

而国内的部分研究则更进一步，将“全成分”的细胞外基质、玻尿酸、外泌体结合，并考察了其在人体上的作用效果。从临床实验中可以发现，该体系能够显著淡化眼纹，令眼部更显年轻态。随着年龄的增加， 部肌肤胶原蛋 流失增加，弹性纤维 化断裂，基底层上真皮与表皮连接不再那么紧密。于是乎，就产生了各类细纹。而通过细胞外基质、玻尿酸、外泌体这一复合体系，一方面外源性途径引入了胶原、糖胺聚糖等重要基质成分，撑起来了眼周结构；另一方面通过其本身的生物学效应，内源性途径增加细胞外基质分泌。通过双管齐下的方式，迅速起效。

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文末小结

随着技术的进步，外泌体已经越来越被人们熟知，其应用也愈加广泛。外泌体是具有纳米尺寸的细胞囊泡，具有高生物活性，能参与细胞之间的交流，调控炎症水平、促进组织再生。然而，外泌体提取较为困难，本身也不具备结构性的功能，因此单独使用有所局限。

作为细胞外基质中的一部分，当外泌体回到细胞外基质中时，能够发挥出更为强大的作用，更起到“锦上添花”的效果。细胞外基质一方面是外泌体最理想的载体，帮助维持外泌体的活性；另一方面细胞外基质能够构建出最适宜再生的细胞外微环境，从而让外泌体能更加有的放矢。

目前，国内外相关的研究正如火如荼地进行中。相信，不久的将来，细胞外基质/外泌体这样的明星组合会越来越多地出现在我们面前。

参考文献

谁持彩练当空舞 ：干细胞基础与临床研究进展

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- 科普 情怀 责任 -

什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍？

外泌体(exosomes)是一种由活细胞分泌，直径在30-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中，内含丰富的蛋白质、脂质以及核酸等生物活性成分。外泌体参与物质运输，还携带和传递重要的生物信息，在介导免疫抗原递呈、树突状细胞的活化、神经退行性疾病发生、肿瘤细胞抗原的转移及肿瘤诊断治疗中发挥重要作用，吸引了很多科研人员的关注，在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。

目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3天，-20℃稳定保存1个月。长期保存需要-80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。

由此，有效保持外泌体的完整性、生物活性和内含物稳定性的外泌体保存液仍有待开发。

外泌体多组学13-EVs转录组综述：cargo内含物以及占比情况讨论

外泌体和微囊泡是几乎所有类型的细胞都能释放的细胞外囊泡(ev)的两大类，在生物液体中非常丰富，ev的分子组成和释放都被认为是受到外界刺激的严格调控的。多项研究一致表明，ev可以在不同的细胞类型之间转移蛋白质、脂质和RNA，从而介导细胞间的通信和信号转导。重要的是，ev中的小非编码rna被认为是在受体细胞中发生的分子事件的主要贡献者。

此外，外泌体和微囊泡中的RNA可以作为多种疾病的非侵入性的生物标志物，包括免疫系统的病理变化。

这篇综述旨在提供ev相关RNA转录组领域的最新技术，以及对以往使NGS测序来描述不同细胞释放的ev中RNA含量的研究进行全面分析。最后，我们强调了与获得纯EV和 EV相关RNA的深度测序 相关的技术挑战。

细胞外囊泡分为三种类型（ classifified by their origin and biogenesis）：apoptotic bodies (ABs), microvesicles (MVs, also known as shedding vesicles), and exosomes。

大肿瘤小体(LOs)已被确定为第四种类型的ev，它是由肿瘤细胞脱落的膜泡产生的，其大小与 ABs相似。

它们直径大小不一，包含物也有所差异：MVs和外泌体包含各种细胞质和膜解蛋白以及脂质、糖和核酸（9），而ABs可能还包括核组分和细胞器。

marker特征差异：外泌体特征良好的蛋白标记物包括各种四酯蛋白，如CD9、CD63和CD81；而mv包含质膜常见的跨膜蛋白，如整合素和选择素；同时，ab可以通过组蛋白的存在来区分。

在多种早期RT-qPCR技术以及最近的报道中，外泌体和MV中的mRNA、miRNAs和lncRNAs得到了一致的证实。更先进的高通量RNA测序方法的应用揭示了，从生物液体和细胞条件培养基中分离的ev亚群中存在各种其他RNA种类。

这些RNA种类包括snRNA、snoRNA、piRNA、vault RNA、Y-RNA、scRNA、SRP-RNA和7SK-RNA；以及来自rRNA、tRNA、mRNA、lncRNA和各种基因间重复序列的短片段。

TABLE 1 | 使用高通量测序显示EV转录组含量的报告

Nolte-‘tHoen等人通过高通量测序研究了培养过程中免疫细胞释放的EV中的小RNA含量。从EV中分离出的总RNA大部分是小RNA (200 nt)，含有少量的18S和28SrRNA。这些短RNA片段主要定位于蛋白质编码区和基因组重复序列，包括SINE、LINE和LTR序列。相反，细胞小RNA群体中存在的大部分序列代表miRNAs，而细胞分泌的EV中miRNAs的比例显著较低。

除了编码mRNA和重复序列的蛋白质外，EV组分还包含所有类型的结构RNA(如vaultRNA、Y-RNA、snRNA、snoRNA、SRP-RNA和tRNA)以及来自lncRNA和假基因的片段。

此外，相对于细胞RNA来说，许多小非编码转录本在EVs中富集，这表明细胞可能选择特定RNA进行细胞外释放。

许多其他研究也证实，由各种培养细胞释放的外泌体中，miRNA 的表达明显低于其他种类的 RNA，这些数据与先前的观察结果一致，即大多数个体外泌体不携带任何生物学上有意义的 miRNA 拷贝。然而，其他的 RNA 测序实验表明，一些细胞系释放的外泌体中相当大比例的小 RNA-seq reads仍然与 miRNA 相对应。

有趣的是，几个独立的小组观察到有15-50% total reads RNA 片段比对到包括逆转录病毒序列，LTR，SINE，和 LINE 序列的基因组重复序列。需要指出的是，作者并没有明确说明在上述研究中使用的小 RNA 文库制备方案是否包括允许捕获5′-OH 和/或3′-磷酸化 RNA 的修饰。因此，目前尚不清楚他们是否真的在相应ev中表征了小RNA的全谱特征。

Jenjaroenpun 等人和 Miranda 等人分别报道了在 MDA-MB 细胞培养液和尿液 EVs 中总 rna (包括长 rna 和小 rna)的测序，并显示了相当比例的 rRNA 读数(87-97%) ，与细胞质中的 rRNA 含量相似。在剩下的3-13% 的片段中，大约一半被标记为蛋白质编码转录本，另一半则标记为非编码 rna 和基因组重复序列。

在Beradrocco等人的另一篇报道中，作者分别使用total RNA和sRNA测序protocols来表征四种不同肝癌细胞系释放的EV中封装的长RNA谱。总RNA片段比对到rRNA的比例最大(32-66%)，而基因组重复序列的比例为15-44%，只有11 -25%的片段映射到蛋白编码和非编码RNA基因。对相同EV制剂进行的sRNA测序显示，RNA类别的分布略有不同:rRNA(16-54%)、基因组重复序列(24-40%)和转录组(24-51%)。

在另一项与small RNA测序相平行的全转录组RNA-seq研究中，Lasser等人证实，人类mast和红白血病细胞系释放两个外泌体群体(通过密度梯度浮选分离为HD和LD组分。在HD和LD部分中，长和短RNA cargo明显缺乏相关性，这表明这两个部分的细胞外RNA与不同的通路相关。与LD外泌体相比，HD中mRNA转录本的reads比例更丰富(75 vs. 20%)，而非编码RNA的分布则相反(25 vs. 80%)。 在 short RNA libraries，HD部分富集成熟miRNA(23%)，而LD部分主要是tRNA(28%)和成熟miRNA(10%)。

另一项研究研究了黑色素瘤细胞在培养过程中释放的三种不同EV类型的RNA含量，并确定了一些非编码RNA在每个EV样本中富集。RNA图谱表明，在相对中等水平的sRNA水平的ABs和MV中存在显著的18S和28S rRNA峰。相比之下，外泌体主要包含小RNA，与ABs和mv相比rRNA更少。尽管EV亚群的miRNA装载量与外泌体略有不同，但大量的miRNA仅在外泌体中被检测到，而在ABs和MV中均不存在，这支持了外泌体富集特异RNA的概念。必须指出的是，与miRNA相比，其他ncRNA种类不仅显著丰富，而且选择性富集在黑素瘤细胞释放的不同EV亚型，这增加了研究细胞外囊泡RNA货物及其功能的复杂性。

到目前为止，只有少数报道对从人类生物液体中分离的EV中的小RNA货物进行了下一代测序。这些研究表明，从人血浆、唾液和尿液中分离出的外泌体含有相当比例的miRNA reads(35-76%)。

上述生物流体EV中其余的RNA种类包括rRNA、lncRNA、tRNA、mRNA、重复区域以及小的非编码RNA如piRNA、snRNA、snoRNA等。值得一提的是，与“几天”细胞条件培养基相比，从生物体液中分离出的外泌体可能含有大量的大蛋白聚集物，包括通常在细胞死亡时释放的装载mirna的AGO复合体。因此，在人类体液中检测到的miRNAs是否确实与ev相关仍有待验证。

有趣的是，对尿液外泌体纯化的总RNA进行深度测序发现，其转录本分布与Cheng等人(48)观察到的完全不同。具体来说，大部分(约87%)的RNA reads被映射到rRNA上，只有约8%的reads被映射到非编码RNA和DNA重复序列上，而剩下的约5%对应于蛋白质编码RNA。相反，Miranda等报道的图谱统计和reads分布与细胞条件培养基中外泌体的总RNA测序结果相似。

综上所述，从上述研究演变而来的集体证据(表1)认为，大多数细胞释放的EV确实携带大量的非编码转录本和蛋白质编码转录本，以及它们的部分，在研究细胞外RNA对受体细胞的影响时应该考虑这些。

EVs RNA载物含量的差异可能部分是因为:

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。