血清中的外泌体提取试剂盒（血浆外泌体提取试剂盒）

本文目录一览：

• 1、外泌体提取策略
• 2、细胞怎样从外界获得物质和能量，在这个过程中细胞膜
• 3、靠一滴血就可验出癌症？日本企业研发出检测新试剂
• 4、在载玻片的培养液的液滴中放几丝棉花签为有什么作用？
• 5、如何对exosomes进行成分分析

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。 

细胞怎样从外界获得物质和能量，在这个过程中细胞膜

用人的红细胞，放在清水中，让其吸水胀破，得到：

（1）分隔、形成细胞和细胞器，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境，膜的面积大大增加，提高了发生在膜上的生物功能；

（2）屏障作用，膜两侧的水溶性物质不能自由通过；

（3）选择性物质运输，伴随着能量的传递；

（4）生物功能：激素作用、酶促反应、细胞识别、电子传递等。

（5）物质转运功能：细胞与周围环境之间的物质交换，是通过细胞膜的砖运动功能实现的，其主要转运方式

靠一滴血就可验出癌症？日本企业研发出检测新试剂

针对疾病的检验技术发展可说是日新月异，人类依靠生物科技让许多疾病的检测更加快速，所以也不断有人拿着快速方便检验疾病的新式营造商机，但有的确定是造福病患的新科技，也不少个案事后被证明只是夸大功效或是欺骗外界。

「女版贾伯斯」曾创造了一个滴血检验的骗局

例如由伊莉莎白·安妮·霍姆斯（Elizabeth Anne Holmes）所成立的Theranos血液检测公司，因为声称提出只需少量血液即可进行200多项疾病检验的创新技术而声名大噪，一度成为生物科技领域的热门公司，但不久后就被新闻界和监管机构质疑该公司对外宣称技术的真实性，遭到美国证券交易委员会以「大规模诈骗」罪名提出诉讼，而联邦大陪审团则起诉霍姆斯9项电汇诈骗罪以及2项串谋电汇诈骗罪，让这个欺骗世人的谎言遭到揭穿。

日本东丽集团宣称也开发血验癌的试剂盒技术

但滴血验癌的话题仍旧未因此而消声匿迹，根据日前《日本经济新闻》的报导，一家叫做东丽株式会社将于近日向日本厚生劳动省递交申请，寻求批准生产和销售透过一滴血液来早期检查诊断多种癌症的试剂盒。

相关报导指出，东丽工业株式会社采取基因检测的原理，利用血清中抽取的microRNA，研发出只用一滴血就能检测各种癌症的方法，患者只需花费几万日元（日币对新台币汇率约为1:0.29）就能一次检测多种癌症，该公司宣称检验准确率超过95%，研究项目中成功锁定了乳腺癌的5种、大肠癌的3种等掌握各种癌症关键的小分子核糖核酸，包括胰腺癌等多类癌症可以被早期诊断，而获得及时治疗。如果顺利获得官方批准，最快可于2020年上市。

滴血验癌的技术遭到医界质疑，有其局限性

不过，这种新式的「滴血验癌」的科技，也逃不过部份科学家与医界人士的质疑。首先，东丽宣称可以它们的检验方式拥有比其他检测晶片高出100倍的灵敏度就让人难以置信。有医界人士指出，一滴血里面含有的microDNA极其微量，一般而言，在临床上用血夜做基因检测都要抽到10毫升血液，只靠一滴血来检测，代表出错率会更高、准确度愈低。

不过，东丽所主张的血液验癌的技术原理也并非空穴来风，因为当细胞发生癌变但尚未形成病灶之前，就会在人体血液中出现肿瘤的标志物，例microRNA、循环肿瘤DNA（ctDNA）、蛋白质、外泌体和循环肿瘤细（CTCs）透过分析这些成分，医生就可以对患者进行早期筛检、诊断癌症的发展与变化。

而目前血液验癌相关科技的发展，已确认可以适用于非小细胞肺癌、乳腺癌、食道癌、大肠癌等癌症的诊断与辅助治疗，但却并非万能，因为并非所有肿瘤细胞都会将突变的DNA释放到血液中。而针对各种癌症检测灵敏度也各有不同，例如针对胶质母细胞瘤的检出率只有57%。

此外，血液检验癌症还面临许多挑战，例如受检的DNA片段太小、半衰期短、来自正常DNA污染的风险，以及随着治疗效果显现，肿瘤DNA比例会大幅度下降等等因素，显血液检验至今并不能完全代替组织检验，甚至还不能完全作为一项诊断检测手段。

目前血液检测癌症的技术已有相当进展

不过，各国科学家仍致力于研发新式的早期癌症检测技术，并获致了一定的进展。例如由名古屋大学、九州大学及日本国立癌症研究中心共同组成的研究团队，在2017年公布了透过1毫升尿液来检测肺癌、摄护腺癌等癌变的新技术。而美国约翰斯·霍普金斯大学的研究团队则在2018年也对外发布8种癌症的临床诊断方案，透过对16个基因的突变以及对应表达的8种蛋白标记物进行癌症检测。

只不过，这些研究结果目前都只停留在动物实验或是人体实验的初期阶段，并未进入商业量产运用，至于日本东丽集团所提出的一滴血验癌的技术，迄今尚未在任何国际知名学术期刊发表，其可信度目前还只能打个大问号。

在载玻片的培养液的液滴中放几丝棉花签为有什么作用？

应该是生物学。这是为了限制观察物品的活动区域，便于观察其形态结构。

例如：草履虫靠纤毛的摆动在水中旋转前进，为便于观察，常在载玻片上的液滴中放几丝棉花纤维来限制它的运动；用低倍显微镜可以观察到草履虫的形态和运动。

如何对exosomes进行成分分析

外泌体（Exosomes）是一种直径在40～100 nm的圆形单层膜结构，可由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中。外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。2007 年，Valadi等发现细胞分泌的外泌体中含有生物学活性的mRNA、microRNA，使得研究人员对外泌体的研究热情激增。

传统的外泌体分离要涉及超速离心，操作繁琐、过程冗长，所得到的外泌体纯度较低。美国101Bio提供的系列外泌体分离试剂盒，可从细胞培养基或血清中富集大量完整的外泌体，试剂盒具有

ü 方便——无需超速离心；

ü 快捷——不到2个小时即可完成外切体分离纯化；

ü 高回收率——是超速离心的5~10倍；

ü 高纯度——所得外切体纯度高达95% 以上；

ü 仅需2ml的细胞培养基或200ul血清，即可获得足够的外切体用于下游研究。

PureExo®Exosomes Isolation Kit for Cell Culture Media

试剂盒组分

Solution A、Solution B、Solution C和PureExo® Columns

操作步骤

1. 无血清培养或血清饥饿48小时的细胞培养液于4℃ 600 g 离心10mins取上清；

2. 在玻璃管中按照比例加入细胞上清液及ABC混合液摇匀；

3. 于4℃孵育1h后出现分层；

4. 弃上层培养基，并将其余液体转移至EP管；

5. 1000g离心3mins，出现分层，弃上层培养基及下层无色澄清液体；

6. 上述步骤重复操作一次；

7. 室温干燥5~10mins后用1X PBS重悬；

8. 重悬液转移至纯化柱中，2000g离心5mins；

9. 收集流出液即为外切体。