外泌体pkh26摄取时间（pkh26染色外泌体）

本文目录一览：

• 1、什么是外泌体？
• 2、什么是外泌体_外泌体是什么？
• 3、外泌体是做什么的？
• 4、外泌体是什么？
• 5、细胞外泌体是什么？
• 6、Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移

什么是外泌体？

什么是外泌体

人到中年，最难以启齿的矛盾便是脸上越来越多的皱纹和内心与日俱增的

“抗老需求”之间的矛盾。为了今天的容颜不被明天改变，什么玻尿酸、水光针甚至是干细胞美容，我都勇于“尝鲜”。而作为美容界的后起之秀——“外泌体”，我更是不愿错过。毕竟它虽然是近两年兴起的美容模式，但其发展历史也已经有40多年了，而它的美容功效更是有口皆碑，比干细胞美容有过之而无不及，一时间，关于外泌体美容的宣传铺天盖地，可谓是风头无两，颇有“江湖大佬”的地位。但也正因为如此，我们更要科学严谨的对待外泌体美容，了解它的原理，才能更好的应用它。

外泌体，从字面上看，就是细胞向外分泌的物体。科学释义是：细胞所分泌的直径为30~150nm的双层磷脂囊泡，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。

外泌体的作用机理

外泌体最大的功能便是人体的“通信兵”，它能在细胞间传递物质，从而调控受体细胞的功能及生物学行为。通俗的说，外泌体就好像一辆“细胞货拉拉”，装了自家一堆有用的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，进行“卸货搬家”。

希吉亚外泌体分离方法

外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，希吉亚外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、免疫磁珠法等。

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超速离心法：超速离心法是大家最熟悉的一种分离方法，文献中应用最多且也是目前比较受到认可的方法。超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法耗时耗力，往往需要8-30个小时；且需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。

希吉亚外泌体美容机制

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免疫磁珠法：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。

促进细胞再生。外泌体可以有效刺激受体细胞，释放细胞活力，促进其再生和新生。因而可以帮助淡化祛除斑点，促使肌肤光亮细腻。

修复受损细胞。外泌体外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成，从而让帮助修复受损的肌肤屏障。而且它可以提高受损部位的修复能力和愈合能力。

抑制炎症产生。外泌体可以诱导巨噬细胞向M2型极化，从而降低了巨噬细胞诱发炎症反应的能力，从而抑制炎症。我们肌肤的很多问题都与肌底炎症有关，而外泌体可以通过抑制炎症来让肌肤从内而外的健康起来。

干细胞疗法围绕使用完整细胞来替代丢失的组织。相反，外泌体是与细胞分离的囊泡。外泌体促进恢复青春活力的方式是利用外泌体中携带的有效成分来帮助其他细胞。

干细胞和外泌体的另一个主要区别是前者仅从身体的特定部位获得，例如：骨髓、血液、脂肪组织。而外泌体，可以从几乎所有类型的细胞中获得。胎盘中也含有大量的外泌体。

通过上述科普，大家对外泌体美容一定有了更全面的认识

什么是外泌体_外泌体是什么？

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

外泌体是做什么的？

外泌体（Exosomes）是一种双磷脂膜囊泡，含有蛋白、脂质及核酸等多种成分，是细胞外囊泡的一种。外泌体体积小，直径在40～200 nm,在透射电镜下具有典型的杯状结构。几乎所有的细胞都分泌外泌体，外泌体在细胞间的连接中发挥重要作用。

01、外泌体的形成

细胞发生内吞后，内陷的细胞膜形成数个小囊泡，小囊泡相互融合形成了早期内体（early endosome），逐渐成熟的早期内体膜多处凹陷并向内出芽形成含管腔状囊泡（intraluminal vesicle,ILVs）的晚期内体（late endosome）；富含ILVs的内体称为多囊体（multivesicular body,MVBs）。MVBs有两个去向：一部分MVBs与溶酶体融合，以降解其内容物；另一部分MVBs与细胞膜融合，释放ILVs到细胞外，这些分泌的ILVs即为外泌体。

02、外泌体的功能

外泌体是一种细胞连接物，能够输送蛋白、脂质及核酸到靶细胞，可以在血管形成、抗原呈递、炎症反应和细胞增殖及分化等各种生物过程中发挥功能。

外泌体可以通过两种途径影响受体细胞，其一，外泌体和受体细胞间的配体-受体相互作用，无需将外泌体或其内容物内化到靶细胞。其二，外泌体通过膜融合或内吞作用进入细胞，其成分被摄取后释放到细胞质中，通过调节特定的基因表达和信号通路影响宿主细胞，最终导致细胞功能或表型的改变。

外泌体是什么？

外泌体于1983年首次被发现，是由于细胞膜内吞形成内体，内体限制膜发生多处凹陷，向内出芽形成微囊泡，从而形成的具有动态亚细胞结构的多囊泡体。大多数类型的细胞均可分泌外泌体。构成外泌体的主要成分为蛋白质、核酸和脂质。外泌体有多种分泌途径，对细胞间通信、疾病的传播及组织修复具有重要的调节作用。外泌体与受体细胞的结合方式多种多样，外泌体可以将膜蛋白或其内容物转移至受体细胞，也可以直接与受体细胞膜融合；此外，外泌体上的跨膜蛋白还可以直接作用于受体细胞膜表面的信号分子。外泌体广泛存在于生物体的免疫应答反应中，外泌体可以通过介导促炎症反应来促进免疫反应，肿瘤细胞分泌的外泌体还可以抑制免疫反应。肿瘤细胞分泌的外泌体可以促进癌症的侵袭和转移，加快癌症部位的血管生成，有助于肿瘤微环境中的上皮间充质转化，并且增强肿瘤的耐药性。外泌体通过与受体细胞特异性结合的方式，传递各种生物学信息，发挥重要的生物学作用。

细胞外泌体是什么？

外泌体——是一类有细胞释放的细胞外囊泡。外泌体的特点见正文。

细胞外囊泡——简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。细胞外囊泡有不同的亚群，而目前研究最火热的是外泌体这个亚群。

然而由于目前很难纯化到非常纯的外泌体亚群，人们纯化到的通常是直径小于200nm的囊泡，因此越来越多的人开始称之为sEV（即 small extracellular vesicle，小细胞外囊泡）。为了严谨，所以今天我们也以细胞外囊泡来称呼这些膜泡结构。本文中没有特殊说明的情况下，细胞外囊泡主要指外泌体和微囊泡。

今天主要介绍内容包括细胞外囊泡的研究意义、细胞外囊泡的分类、细胞外囊泡含有的成分、细胞培养上清的制备、细胞外囊泡的保存、细胞外囊泡的鉴定实验要求。所有内容都参考目前已发表的综述，并非hzangs杜撰。所以请新朋友们放心学习。

细胞外囊泡的研究意义

目前，细胞外囊泡的功能还没有完全阐明。已有的报道认为它们能够调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，已有文章报道细胞外囊泡在发育中也发挥着重要作用。细胞外囊泡在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。

细胞外囊泡的分类

细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会（ISEV）创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。

细胞外囊泡含有的成分

细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息。 实际上，这些纳米尺寸的细胞外囊泡能够携带蛋白质，脂质，核酸和糖等生物活性分子在细胞间传递信号，并且其包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型。有一个复杂的分选系统来决定那些分子能够进入细胞外囊泡。

细胞培养上清的制备

目前有两个策略来制备细胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清（FBS）培养基培养细胞和使用不含FBS的培养基培养细胞（血清饥饿细胞）。但是目前一些高水平的文章报道使用的方法通常是前者。另外，有些文章开始关注去除细胞外囊泡的胎牛血清中游离RNA对实验结果的影响，但是目前并没有形成共识。如果需要先储存培养上清，一定量后再用于细胞外囊泡分离，那需要预先去除体系中的死细胞和细胞碎片。

细胞外囊泡的保存

Lőrincz等人曾对中性粒细胞来源的细胞外囊泡做了不同条件的储存，之后再去分析这些囊泡的特性，他们发现虽然细胞外囊泡样品中囊泡数量和形态没有明显变化，但即使是储存在-20或-80摄氏度情况下的细胞外囊泡也存在磷酯酰丝氨酸外翻明显增多的情况；但他们同时也发现，尿液来源的细胞外囊泡并没有这些变化。Kalra等人分离了来自结直肠癌细胞的细胞外囊泡，不同条件保存一定时间后进行PKH67染色跟踪细胞外囊泡的摄取，分析发现这些囊泡依旧可以被细胞摄取。就目前的情况，学者们并未就储存条件对细胞外囊泡是否有影响达成共识。因此建议大家实验时分离细胞外囊泡后尽快用于实验，尽量减少储存过程。

细胞外囊泡的鉴定及实验要求

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

今天就先介绍到这里。细胞外囊泡领域作为生物学研究中的一个新兴领域越来越受到学者和生物公司的关注，也有越来越多的研究报道出现。但是我们也要清楚的认识到该领域的研究技术依旧不完善，对细胞外囊泡的认识依旧不充分，细胞外囊泡研究依旧处于一个起始阶段，要走的路还很长。

Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移

前言

肝细胞癌（HCC）是世界上第五大常见癌症，以及全球癌症死亡的第五大原因。大部分HCC患者出现转移，其中肺转移的总体生存率约5.9月，无转移患者总体生存率约16.2月。肺转移在恶性肿瘤中的发病率约25%-30%，HCC患者发病率约41.6%-43.6%。

肿瘤细胞与相应微环境的相互作用以及基质细胞参与肿瘤进展的重要性。肿瘤的基质细胞有内皮细胞，纤维母细胞，肿瘤浸润的炎症细胞，这些细胞创造微环境，改善肿瘤细胞的特性，调控肿瘤的发展及对治疗的应答。研究表明，肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）可以加速肿瘤的发生、发展。巨噬细胞根据极化特性分为M1和M2型，M1型巨噬细胞能够分泌促炎症和免疫刺激因子，TAMs比较接近M2型巨噬细胞，可以激活产生Th2细胞因子。TAMs加速癌细胞转移以及癌细胞与TAMs对话的潜在机制有待进一步阐明。

外泌体是一种包含蛋白、核酸、脂质的微小囊泡，参与肿瘤微环境中不同类型细胞间的物质运输、信息传递。由于TAMs外泌体与肿瘤的研究是有限的，所以TAMs外泌体对肿瘤的发生发展和转移也需要进一步探索。

最近发表于Hepatology杂志（IF=14.679）的研究指出，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来源的外泌体介导CD11b/CD18蛋白转移到肿瘤细胞，可能增强了肝癌细胞迁移能力，为肿瘤转移机制提供新的见解。

◆ 技术路线 ◆

在这项研究中，研究人员获取120例肝癌vs. 癌旁，转移vs. 非转移临床样本，CD206、CD68在肝癌和HCC非转移组织样本中表达显著升高，且CD206、CD68高表达患者预后较差。

功能上，M2型巨噬细胞/M2型巨噬细胞条件培养基与肝癌细胞共培养，促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

PKH26染色示踪肝癌细胞吞噬外泌体效率；M2型巨噬细胞来源外泌体（M1 exos）介导肝癌细胞迁移和侵袭；GW4869（外泌体抑制剂）逆转迁移和侵袭表型。

体内实验表明，巨噬细胞来源外泌体预处理肝癌细胞，尾静脉接种到小鼠。与对照、M1 exos相比，M2 exos组肺转移显著增强；GW4869可以逆转体内肺转移表型。另外，M2 exos组总体生存时间也显著降低。M2 exos增强HCC细胞侵袭能力，可能是巨噬细胞和肝癌细胞之间的一种新的信息传递模型。

蛋白质组学测序：M2 exos 组显著上调的蛋白有：FGL2，FABP4, CD37, ITGB2 (CD18 or β2 integrin), ITGB5, and ITGAM (CD11b or αM integrin)。体内和体外研究结果表明，CD18 、CD11b在M2 exo中高表达，可通过M2 exo传递到HCC细胞；CD18 、CD11b抗体阻断后迁移和侵袭能力也下调，小鼠存活时间延长。

前期研究结果表明，在肿瘤发生的初期，MMPs降解胞外基质介导肿瘤的侵袭和转移。研究者通过WB、qPCR、ELISA实验发现M2 exo处理的肝癌细胞中MMP-9表达上调，CD18 、CD11b抗体阻断后MMP-9表达量下调；MMP抑制剂（MMPi）或联合M2 exo处理肝癌细胞，其迁移和侵袭力下降；另外MMPi处理的肝癌细胞接种小鼠，肺转移数目显著降低。

总之，本研究阐明了M2 exo传递αMβ2到肝癌细胞，激活受体细胞表达MMP9，从而促进肝癌转移。

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