血清外泌体检测（血清外泌体和血浆外泌体）

本文目录一览：

• 1、血清外泌体取血清时要空腹吗？
• 2、如何对exosomes进行成分分析
• 3、实战分享 | 外泌体提取之经验小结

血清外泌体取血清时要空腹吗？

绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍

如何对exosomes进行成分分析

外泌体（Exosomes）是一种直径在40～100 nm的圆形单层膜结构，可由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中。外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。2007 年，Valadi等发现细胞分泌的外泌体中含有生物学活性的mRNA、microRNA，使得研究人员对外泌体的研究热情激增。

传统的外泌体分离要涉及超速离心，操作繁琐、过程冗长，所得到的外泌体纯度较低。美国101Bio提供的系列外泌体分离试剂盒，可从细胞培养基或血清中富集大量完整的外泌体，试剂盒具有

ü 方便——无需超速离心；

ü 快捷——不到2个小时即可完成外切体分离纯化；

ü 高回收率——是超速离心的5~10倍；

ü 高纯度——所得外切体纯度高达95% 以上；

ü 仅需2ml的细胞培养基或200ul血清，即可获得足够的外切体用于下游研究。

PureExo®Exosomes Isolation Kit for Cell Culture Media

试剂盒组分

Solution A、Solution B、Solution C和PureExo® Columns

操作步骤

1. 无血清培养或血清饥饿48小时的细胞培养液于4℃ 600 g 离心10mins取上清；

2. 在玻璃管中按照比例加入细胞上清液及ABC混合液摇匀；

3. 于4℃孵育1h后出现分层；

4. 弃上层培养基，并将其余液体转移至EP管；

5. 1000g离心3mins，出现分层，弃上层培养基及下层无色澄清液体；

6. 上述步骤重复操作一次；

7. 室温干燥5~10mins后用1X PBS重悬；

8. 重悬液转移至纯化柱中，2000g离心5mins；

9. 收集流出液即为外切体。

实战分享 | 外泌体提取之经验小结

近些年来，关于外泌体的研究如火如荼。外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。 来自华中科技大学同济医学院附属协和医院的崔老师，对外泌体提取积累了自己的心得，并将自己的研究成果发表在 Bioactive Materials 上。 下文是崔老师的分享。

要进行关于外泌体的研究，提取纯化外泌体一直是大家非常关注的问题。 能否获得较高纯度的足量外泌体，直接关系着后续研究能否开展 。虽然目前仍然没有能同时保证外泌体的含量、纯度和生物活性的提取方法，但是我们可以结合当前的实际情况，对外泌体提取做一些探讨和经验总结。

超速离心（差速离心）法是目前最常用的外泌体提取方法 ，即采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎。本人近期发表的论文中最后也是采用了这种方法。

具体的步骤大家都比较熟悉，无论是提取血清来源的外泌体，还是细胞条件培养基来源的外泌体 ，大家都习惯于先将血清或者条件培养基收集后保存于-80℃的温度下，等达到一定量后，再批量进行超速离心。

这样的话， 大家会发现一个非常严重的问题，尤其是在拍摄电镜的时候——背景杂质很多，并且很多囊泡的形态不够典型，不是文献中描述的那种典型的双凹圆盘状或者茶托状。

通过几次实验的对比，我大概发现了原因， 主要是由于在冻存收集到培养基的时候，没有进行低速离心和普通高速离心。

低速离心可以去除培养基中的未贴壁细胞、死细胞以及大的细胞残骸，而普通高速离心可以去除其中的大型细胞外囊泡。无论是未贴壁细胞、死细胞、大的细胞残骸，还是大型细胞外囊泡，在-80℃冻存及复温的过程中，都会发生破裂，产生小型的细胞膜碎片结构。

这样的话，就导致了电镜背景很杂乱，难以达到高水平论文杂志期刊的要求。另外，还会导致这样一个矛盾现象，即蛋白定量中计算的外泌体产量虚高，而蛋白免疫印迹中外泌体标记物蛋白的含量却不高。

因此，在这里推荐给大家一个小贴士

就是在收集准备提取外泌体的条件培养基或者血清时，一定要提前做到低速离心和普通高速离心这一步，尤其是为了做透射电镜或者蛋白免疫印迹实验而提取的外泌体 ，一定要注意这一点。尽管过程比较费时，但是能生产出有用的结果才是更重要的。

至于其他的外泌体提取方法，如密度梯度离心、色谱柱、超滤离心法、微流控芯片法、磁珠免疫法、多聚物沉淀法，我看到学校里面鲜少有人去尝试，毕竟更麻烦。但不同的方法各有优劣，大家可根据自己的实验，谨慎选用。