外泌体抽提（外泌体提蛋白）

本文目录一览：

• 1、蛋白的表达与纯化
• 2、煤系分散有机质
• 3、术能和普通饮料区别
• 4、思路迪诊断NGS的检测流程是什么？
• 5、常用的工业酶有哪些?

蛋白的表达与纯化

pET，原核表达金标准（转）

pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点

· 是原核蛋白表达引用最多的系统

· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低

· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制

· 提供各种不同融合标签和表达系统配置

· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌

· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物

· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化

阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET 系统概述

pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平

pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 λ DE3 溶原菌。

有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。虽然不如用 IPTG 诱导 λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性 T7 lac 启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。

控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。

选择 pET 载体

所有的 pET 载体均来自 pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。

选择要点

选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

· 所表达蛋白的用途

· 所表达蛋白的已知信息

· 克隆策略

pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。 LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭 ( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b （ + ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。

使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的 FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。

各种融合标签和相应 pET 载体见列表。一些 pET 载体带有数个***的融合标签，作为 5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC 载体 Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。

pET NusA 融合系统 43.1

在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白

新推出的 pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与 495aa NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中 4000 个以上蛋白进行可溶性建模， NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同 NusA 融合蛋白进行的试验中，大于 85% 的表达蛋白都是可溶的。 pET-43.1 载体含有 Nus.Tag 融合伴侣并与 trx/gor 突变体 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用 pET-43.1 载体和这些 trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。

优点

· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侣

· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可选择的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合标签

· 凝血酶和肠激酶切割位点

· 多克隆位点位于所有读码框中

· 与 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭

pET 宿主菌株感受态细胞

所有 pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

（ DE3 ）指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。

HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。

NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。

Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。

Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。

重组蛋白的纯化

煤系分散有机质

煤成气勘探和资源评价的工作促进了煤系有机质的成烃机制研究。为揭示煤系有机质的成烃演化规律，运用有机地球化学和煤岩学研究的新方法、新技术，以重点解剖鄂尔多斯地区石炭-二叠系海陆交替相煤系中煤、干酪根及可溶烃类的有机地球化学性质为例，建立了以镜质体反射率为尺度的腐殖煤及暗色泥岩有机质热演化剖面。为了直接观察煤系有机质在成熟演化中的全部生成物，尤其是运移排出物的数量、组成、性质及演化特点，选用了第三系、侏罗系、二叠系和石炭系的低阶煤及未成熟腐殖型泥岩进行了热压模拟实验。通过实验获得5种产物——残渣、残留沥青、水、轻质油、气的计量和配套地球化学分析，基本弄清了其演变规律，并获得几条重要的成烃界线。本节着重讨论煤系有机质的成烃演化问题。

4.1.1 煤系有机质的性质和组成结构特点

前人已对腐殖煤的生源物质、形成环境、地质和化学特征等有过大量论述。近年来，有机地球化学工作者又对腐殖型泥岩中的分散有机质进行了相当多的研究。通过对鄂尔多斯地区及其他盆地含煤岩系与生油层系有机质性质的研究比较，认识到煤系中有机质具有如下特点：①元素组成为低氢高氧；②颗粒组成为富镜质体和丝质体；③平均结构以贫脂链（环）结构、富芳香结构、含氧基团偏多；④有机碳、沥青、烃及热解分析总生油势（S1＋S2）等绝对量高，但沥青/有机碳、烃/有机碳、有效碳/总有机碳等烃转化程度最低；⑤氮仿抽提沥青的族组成富沥青质与非烃，元素组成低氢富氧氮硫，在基团组成上长链烷烃少、芳烃构化程度高；⑥芳烃组分中脂肪侧链短而少、含芳核比例及络合程度高；⑦饱和烷烃中往往有姥鲛烷对植烷的优势组成；⑧热解产物少正烷烃、烯烃，多芳烃和重杂原子化合物；⑨富集同位素13C（从固体有机质到油气具系列性）族，组成碳同位素分布曲线往往有不同于生油岩的δ13C饱＜δ13C芳＞δ13C非＜δ13C沥特殊分布；⑩干酪根易氧化度高。

将煤系中腐殖煤与腐殖型暗色泥岩的性质加以比较（表4.1），其基本性质是相同的，但也存在一些差别：①多数泥岩干酪根比煤富含丝质组分（多20%～40%）、少镜质组分（低20%～50%）；②多数泥岩干酪根中所含的少量无定形颗粒在煤中几乎见不到；③泥岩干酪根和抽提沥青的红外分析均说明其含氧基团比煤多；④泥岩干酪根的成烃指标分析（如H/C、2920cm－1/1600cm－1、CP/Cot）表明比煤略差；⑤泥岩的残留沥青转化率比煤偏高，沥青的族组成性质比煤要好；⑥泥岩与煤的热模拟实验表明，二者最终产烃量（以纯有机质计算）相差不多。上述差别前三点说明泥岩中的有机质随碎屑物经过河水搬运后比煤氧化程度深，这可能是造成泥岩在成烃性质上不如煤的主要原因。不过，这只能用来说明那些腐殖型母质占统治地位的煤系，另一些存在腐殖煤、油页岩和含湖相化石泥岩的有机相变的煤系，显然有相反结果。热模拟实验证实，腐殖型泥岩产出轻质油的能力一般低于煤，沥青产率高于煤，这说明尽管泥岩干酪根中成油组分偏多，但是由于其具有“有机质丰度低、粘土含量高”的特点，在排油效率上不一定比煤强。

表4.1 煤系有机质与生油岩性质及丰度对比

限于分析手段，迄今人们对于煤（或腐殖型干酪根）的分子结构还没有一个清晰的认识。一般认为煤（或腐殖型干酪根）是由多种形式结构单元链接而成的三度空间网络。单元的核心为缩聚的芳核、氢化芳环或各种杂环（初期的芳环多为1～2个环，随着煤化程度加深，环数增加），中间的链接桥键主要是—O—，

，—（CH2）—N，—S—形式的官能团、芳核侧链主要有——COOH，—OH，—OCH3，—（CH2）—N等官能团。碳元素主要集中在芳香族稠环芳烃中，据Wender（1975）提出的褐煤结构式分析，其与I.A.Breger（1951）建立的木质素结构颇为相似（图4.1）。

综上所述，煤系有机质总体反映出“贫氢高氧、贫脂链（环）富芳核”的结构特征。

4.1.2 煤系有机质的成烃特点

4.1.2.1 有机质丰度高，烃转化程度低

高丰度、低转化是煤系有机质丰度和性质的特点。煤、炭质岩以及部分腐殖型暗色泥岩的有机率均大大低于生油岩。如煤的“A”/C一般为2%左右（个别可达4%）、烃/C一般小于1%，腐殖型泥岩“A”/C 一般为2%～5%、烃/C 为1%～3%，一般生油岩的“A”/C和烃/C分别为5%～20%和3%～10%。二者液态烃生成能力悬殊。再如，热模拟实验证明，不同地区4个层系8块煤样最终产烃气平均为171 m3/t原煤（68～232 m3/t 原煤），高峰期产油约30 kg/t原煤（1.14～45 kg/t原煤）；泌80井1块生油岩样最终产烃气454 m3/t有机质，高峰期产油约160 kg/t有机质，二者产气能力相差1.9～6.6倍，产油能力相差2.6～1000 余倍。另外，根据热解分析有效碳/总碳（CP/Cot）指标的比较，煤和腐殖干酪根的成烃效率只相当于生油干酪根的1/3左右。

图4.1 褐煤和木质素的分子结构模型

（据李明潮等，1990）

二者的丰度及成烃能力差异主要由它们的母质来源和组成结构所决定。烃类是以脂链（脂环）为主，且氢碳比最高的碳氢化合物。甲烷的H/C原子比高达4，一般石油的平均H/C原子比约为1.7～1.8。煤系有机质恰恰富含低氢碳比的芳核，缺乏高氢碳比的脂链。从成烃演化机理看，由于芳环碳之间的∏键结合力强，在热演化中主要以缩聚为主，成烃主要表现为脂链脱落和桥键分化，并伴随脱氢加氢等。母体结构如无较多脂链和氢元素，其成烃效率必然较低。但是，高丰度特征显然是对低成烃效率的补足，这一点在综合评价时应予考虑。

4.1.2.2 低分子烃产出倾向

实践表明，煤系油气源岩即使处在“生油窗”成熟阶段，也同样产出以天然气为主的低分子烃类。如陕甘宁盆地胜利井构造气井来自煤系的油气，其油气比为（2.3～9.9）×104m3/t原油，重烃含量5%～8%，利用地球化学指标推测，母岩成熟度Ro为0.88%～1.18%。戴金星曾收集国内、外8个煤系为烃源岩的含气盆地资料，源岩成熟度Ro为0.5%～1.35%，其气油能量比一般大于10，相应成熟度油型气的气油能量比均小于1。热模拟成烃实验也证明，即使是产油率最高的煤（表4.2），其油气比也比生油岩高得多。

表4.2 煤与生油岩热模拟实验产出油气对比

煤系母质的这一产烃倾向绝不是通常的裂解所造成的，而是其分子结构上的内在原因。据分析，煤中脂肪侧链的平均长度仅（1.8～5.0）×10－10m，且随煤化程度加深变短。生油干酪根则不同，据M.Djuricic等用高锰酸盐碱浓氧化法和J.J.Schmidt—Collerue等用显微热解法研究美国格林河页岩干酪根（Ⅰ型）的资料，其降解碎片主要为C10—C36的烃类。所以，成油干酪根当处于“生油窗”成熟阶段时总是以产油为主。如此看来，沉积有机质母体与产物之间性质上的相辅相成是一种宏观的必然现象。这一现象也见于煤系有机质的成烃演化进程中。

煤系有机质分子结构中以短脂肪链占优势的现象与低氢碳比元素组成相对应。缺乏足够数量的氢元素，不仅使其宏观结构偏向芳香性，而且不易形成饱和的长脂肪链。

4.1.2.3 产出较多的二氧化碳等非烃

从表4.3可以看出，3种类型干酪根的热解气组成差异显著。腐泥型干酪根生成气中氢气含量特高，估计是由于实验压力偏低、加氢反应受抑制造成的，因此是一种假成分——实际上的甲烷中间物。腐殖煤生成气中二氧化碳比例特高，二氧化碳是成烃母体在热降解过程中脱羧、去碳基的产物。由于高等植物生长于充氧的大气环境，沉积于还原程度偏低的水体中，因而在成烃母体中富集了较多的含氧基团。排出含氧基团的产物通常是二氧化碳和水。

表4.3 300℃、100 h加热试验后3种干酪根热解气成分比较

二氧化碳组分的富集在煤的低—中演化阶段产物中比较突出，在实际产出的天然气中也得到了反映，如琼东南盆地崖13-1构造天然气中CO2含量高达8%～10%。但在一般煤系气中CO2含量均低于3%，这可能是气的重力分异和CO2在水中溶解度高造成的。

4.1.2.4 一级降解为主的成烃途径

烃类演化的高级产物是甲烷。在有机质成烃演化中期，除甲烷外，尚有重烃气、沥青和油等中间产物。如以最终生成甲烷量为100%，计算中间产物转变而成的甲烷百分比可建立煤或干酪根的成烃降解流程。根据热模拟实验结果计算，对一般腐殖煤来说，来自残留沥青裂解的甲烷约占7%，来自轻质油裂解的甲烷约占13%，直接来自母体煤一级裂解的甲烷约占80%。在相对镜质体反射率绘制烃演化曲线时，总可以看到沥青先于油出现峰值，而在计算中是按各自的峰值进行计算的，所以，这里的一级降解百分数可能偏低。利用相同条件的实验资料计算，在生油岩中来自残留沥青裂解的甲烷约占19%，来自原油裂解的甲烷约占30%，直接来自干酪根的甲烷约占51%。实验还说明，煤的成烃性质愈差，降解的沥青和油等中间产物愈少，其一级降解百分率越高。

根据自然样品分析，生油岩沥青与原油之间往往在性质上有亲缘关系。而煤沥青与轻质油性质相距甚远，且在沥青里一般查不出轻质油，这就意味着，煤中轻质油和天然气的初次运移并不依赖于通常所说的压实作用，而主要依靠热力化学分异作用。

4.1.3 煤系有机质的成烃演化机制

4.1.3.1 自然演化剖面和热压模拟成烃试验所提供的若干成烃演化界线

为了研究煤系有机质的热演化成烃规律，可以从自然演化和人工演化两条平行的途径建立基础资料（图4.2）。

图4.2 鄂尔多斯地区石炭-二叠纪煤系有机质演化特征及成烃模式

（据史训知，1987）

在建立以镜质体反射率为尺度的鄂尔多斯地区石炭-二叠系腐殖煤和暗色泥岩有机质热演化剖面中发现，煤系有机质在以下几方面不同于成油干酪根：①煤和腐殖型干酪根的氢碳比下降的速度与幅度比成油干酪根小；②腐殖煤在Ro为0.5%～0.7%的演化阶段出现了脂肪族基含氧基团，使脂肪族基团的微弱减少不仅被掩盖，而且从相对组成中突显出来。相似的情况还有生油潜力指标S1＋S2，沥青增加过程不明显。以“A”/C计，腐殖型泥炭可增加一倍，煤则很难确定是否存在沥青增加过程。生油岩在热演化过程中可增加3倍于未成熟时的沥青量。

在自然演化剖面中，获得了几处与烃类生成与运移有关的界线：①腐殖煤出现在Ro为0.7%左右的沥青转化下降点，它可以说明沥青降解曾在此演化阶段为煤的烃类生成发挥过重要作用；②正烷烃高碳数部分的“奇偶优势”在Ro为0.73%以后基本消失、在Ro为0.848%时“碳数前移”，类似于井下产出轻质油的碳数分布，可以认为，液态烃生成相运移是在 Ro为0.7%～0.8%时开始的；③暗色泥岩沥青（API）在 Ro为1.1%～1.25%时急剧增大。这些都表明热裂解作用和重排反应的发生，这一变化应和湿气和凝析油的生成有关。

热压模拟成烃实验中获得的成烃界线是：①烃类气体甲烷在Ro＜3.5%之前持续增加，在此以后由于高温裂解为氢气相元素碳而减少；②

重烃气体在Ro为0.5%～0.7%时开始生成，至Ro为1.75%时达到高峰，Ro为3.5%时消失；③轻质油于Ro为0.6%～0.7%时开始生成，在Ro为1.26%左右达到高峰，Ro为2.5%时消失；④煤中残留沥青在Ro为0.5%～0.7%时有少量增加，腐殖型泥岩中残留沥青在 Ro为0.7%～0.8%时出现峰值，二者的沥青均在Ro为1.5%～1.8%时减少至痕量。

4.1.3.2 煤系有机质的成烃演化阶段

按成烃转化的营力不同，可将煤系有机质的成烃演化全过程分为生物化学和地球化学两大阶段。第一阶段主要依靠微生物和化学分解作用完成死亡植物向泥炭的转化；第二阶段主要依靠热力等作用完成泥炭向褐煤、烟煤、无烟煤的转化，或未成熟泥岩干酪根向过成熟阶段的转化。

按生成排出产物的变迁可分5个阶段：①Ro＜0.5%为生化甲烷阶段；②Ro为0.5%～0.7%是热解烃生成初级阶段；③Ro为0.7%～1.25%是气油兼生阶段；④Ro为1.25%～2.25%是湿气阶段；⑤Ro为2.25%～4.5%是干气阶段（图4.2）。

（1）生化甲烷阶段

这一阶段可包括快速氧化和还原条件下缓慢转化两个相互衔接的作用过程（Kur batov，1963）。最初，当植物死亡后，其残体或原地倒伏，或经河水携带沉积于空气流通的表层淤泥中，接受水解及大量真菌或喜氧细菌的分解，变成水和二氧化碳损失掉。但是在死水厌氧沼泽中，部分有机质被分解，部分被转化成腐殖酸保存。随着沉积物的堆积，泥炭转入透气性差的还原界面之下，腐殖酸进一步聚合成腐黑丰褐煤或腐殖型干酪根的前身物。这里的聚合作用主要是以搭桥方式将各单元化合物连接成较大的三维网络，尚不能造成芳核的缩聚。分析表明，腐殖酸或褐煤是一种结构松散、元素成分复杂及结构单元多样的大分子聚合物。

甲烷菌和其他还原性细菌的厌氧发酵作用是这一阶段烃类生成的主要途径。其作用机理是泥炭有机物所含的纤维素、半纤维物质在纤维素分解菌、产氢、产乙酸菌和甲烷菌的分步联合作用下进行的还原性分解。目前我国已知这类气体形成工业聚集的有柴达木盆地七个泉组和辽河断陷有关地区。气体甲烷碳同位素小于－55‰，是判别此类成因气的主要依据。

甲烷是烃类气体的主要成分。柴达木盆地13井七个泉组产出的天然气，其组成CH4为97.84%、N2为2.0 5%、CO2为0.11%，δ13C1为－66.4‰。内蒙古河套水8井第四系产出气亦属生物成因，其组成CH4为73.32%、N2为26.6%、CO2微量，未检出重烃，δ13C1为－72.0‰和－77.9‰。

（2）热解烃生成初级阶段

该阶段是据腐殖煤及腐殖干酪根的特殊性质划分的。在这一阶段，可见到煤及干酪跟中含氧基团大幅度降低、元素氧急剧减少，热解气体中以二氧化碳为主，脂肪基团和生烃势相对升高。

发生在热力作用早期的这种降解状况实际上符合有机反应中的“键离解能”原则。煤和腐殖型干酪根是由大量稳定和不稳定结构单元组成的高聚物，在热力作用下，不稳定结构单元逐渐降解或裂解、向稳定结构单元富集。各种结构单元的稳定度，即键离解能的大小决定着各种官能团的脱落顺序，由此造成了不同热演化阶段的不同降解产物。在条件相同的情况下，其C—C键热稳定性大致有如下规律：芳烃＞环烷烃＞链烷烃；稠环芳烃＞低环芳烃，短链烷烃＞长链烷烃，对称共价键＞极性共价键等。在低温热力作用下，降解首先发生在低能量的键位置，造成脱羧和脱水，肢解出较长侧链的烃和非烃，因而有急剧产出CO2和水（水呈酸性）、可溶沥青有所增加、少量甲烷生成的产物组成。这一阶段产出甲烷的δ13C1为－55‰～38‰。

（3）气油兼生阶段

在前一阶段大量排出含氧结构的基础上，此时进入生烃、排烃的“旺季”。煤中碳的富集、H/C比下降及总生烃势减少变得较为明显，氧的释放变得缓慢。大部分煤在此阶段可生成一些轻质油（少部分煤仅产湿气），

重烃气变多。

H.C.格良兹罗夫指出，有机聚合物热解的基本规律是在已形成的分离产物之间氢的重新分配。一些热解产物被氢饱和形成稳定的饱和分子，而另一些则缺氢成为游离基或不饱和物参与缩聚反应或加成反应。此段论述高度概括了煤在热解过程中的成烃演化行为。换言之，煤在热力作用下一方面生成了富氢、分子虽小的气态烃和液态烃，另一方面残余煤进一步缩聚成更为贫氢的稠环芳核。上述过程又具体反映在桥键的分化上。所谓桥键分化很可能有下列结果，部分桥键闭环脱氢芳构化，部分桥键脱落为带烯键的烷烃，前者脱出的氢加合到后者的烯键碳上使之成为饱和烷烃。

由于烃类的排出，母体煤或干酪根的性质急剧下降，芳香性迅速增强。煤中H/C比从0.9左右下降至0.7左右，芳环碳与总碳之比（fa）从0.732上升至0.812。煤中O/C比仍有下降趋势，从0.2降至0.06左右，不过此时主要脱出碳基和酚类形式的氧（图4.3）。因此，除产出烃类外，仍有部分二氧化碳。此时，煤或泥岩中沥青急剧减少，大部分解体成可运移烃排出。

图4.3 煤在演化中含氧官能团的变化

（据史训知，1987）

（4）湿气阶段

这一阶段的最主要特点是从热降解成烃进入到热裂解成烃。降解即肢解，主要以官能团或链的脱落为主，裂解是指链的打碎。一个最明显的证据是，在Ro为0.7%～1.25%时，热解油δ13C＜煤样δ13C；越过Ro为1.25%界线时，Δ（δ13C油－δ13C煤）开始出现正值。这表明，在此以前热解油来自煤，在此以后油来自本身的裂解分异，12C更多地赋予给了气。这一阶段还可以两分：Ro为1.25%～1.75%，生油终止，煤产出和油裂解出的重烃气达到高峰；Ro为1.75%～2.25%，产出重烃减少，重烃开始裂解为干气，可视为干—湿过渡带。

本阶段的沥青从Ro为1.25%时的少量减少至Ro为1.76%时的痕量。已生烃可达50%～65%。含氧排出可忽略。煤中H/C比从0.72±下降至0.55±，O/C比从0.06±下降至0.02±，fa从0.81上升至0.87。此阶段甲烷δ13C1为－34‰～－30‰。相当该演化阶段的工业气藏有东濮凹陷文留气田、松辽盆地侏罗系等。

（5）干气阶段

该演化阶段的主要特点是高温裂解成烃。煤、干酪根和生成物都跨入了最稳定结构的门槛，生成烃和储集烃的裂解达到充分程度，呈现出甲烷占绝对优势的组成面貌（

＜2%）以及高温裂解氢气的出现（含量5%～10%）。煤中H/C比从0.55下降至0.2±，O/C比从0.02下降至0，fa从0.87上升到1.0。当Ro≥3.5%时，煤的结构将发生叠合芳香片向半石墨形式的过渡。热模拟实验说明，此阶段仍剩余35%～50%的烃转化率。其甲烷δ13C1从－30‰变化至－25‰，最终和母体煤的δ13C相等。

术能和普通饮料区别

1、功能不同：

术能饮料产品是专门为病人在手术前后研发的一种能量营养补充液，用于减轻患者禁食禁饮期间带来的不良症状。

饮料是经加工制成的适于供人或牲畜饮用的液体， 尤指用来解渴、提供营养或提神的液体。汽水及各种果汁等。

2、构成成分不同：

术能饮料含各种营养要素的饮品，满足人体特殊需求。而饮料成分为加工制造的供饮用的液体，如汽水、果子露、茶等。

3、价格不同：

术能饮料比饮料贵。

扩展资料：

术能饮料的发展 ：

2016年4月6日，国内首个专为手术病人研发，打破外企市场垄断的能量补充项目——术能饮料生产项目在夷陵经济技术开发区萧氏茶产业工业园建成投产。

据介绍，术能饮料产品是专门为病人在手术前后研发的一种能量营养补充液，用于减轻患者禁食禁饮期间带来的不良症状，填补了国内市场空白。

术能饮料项目总投资2亿元，是由宜昌人福药业有限责任公司、萧氏茶业集团有限公司联合投资兴建的，整合了双方在生产技术、食品饮料等方面的优势，目前已建成了一条全自动洁净化生产线，年生产能力7500万瓶，可实现年产值15亿元。

参考资料：

百度百科-饮料

百度百科-功能性饮料

思路迪诊断NGS的检测流程是什么？

现在随着全球科学技术的发展，抗肿瘤领域的治疗更加的多元化。比如精准医疗方面，如今NGS（二代测序）已经成为抗肿瘤治疗路上不可或缺的辅助诊断工具。流程如下：

对于接受NGS检测的患者来说，只需要提供组织标本以及无创ctDNA标本，NGS的检测流程非常严格，从样本接收到最终生成报告，思路迪其实需要经历10个流程：接收样本、查病理核查、溶血分离、核酸抽提、文库构建、自动化捕获过程、测序、分析加注释、复核发报告。

在经历严格的复核环节之后，最终的报告就以严谨、可信的姿态呈现到医生和病人的面前了，得出的结果可以为临床医师后续肿瘤治疗的策略提供参考。

官方信息显示，思路迪诊断自思路迪集团分拆而来，专注于精准诊断，目前拥有包括NGS（基因二代测序技术）、qPCR、外泌体核酸/蛋白检测和人工智能数据分析等技术平台，还拥有多家第三方检验所，旗下研发人员超过200名。

目前，思路迪诊断拥有第三方医学检验服务以及IVD设备和试剂两大业务线，布局了包括肿瘤（从早期诊断、伴随诊断到动态监测）和微生物诊断领域的一系列产品研发管线。

其中在肿瘤早期诊断领域，思路迪诊断基于自主的外泌体标志物开发平台，研发出的卵巢癌早期诊断试剂盒已经进入注册临床试验。

另外，在肿瘤伴随诊断和动态监测领域，思路迪在2018年完成了全自动化数据分析系统。紧接着在2019年，旗下研发的具备全自动化封闭式基因文库制备功能的ANDiS400获得中国药监局上市许可。

目前思路迪诊断已经形成了一系列全自动化平台研发管线，并建立了相应的伴随诊断和动态监测自动化产品开发注册管线。未来随着该管线产品的陆续上市，有助于突破肿瘤NGS技术因为过于复杂而无法规模化在国内医院落地的瓶颈。

常用的工业酶有哪些?

酶制剂工业是知识密集的高科技产业,是生物工程的经济实体.据台湾食品工业发展研究所统计,全世界酶制剂市场以年平均11 %的速度逐年增加.从1995 年的12. 5 亿美元增加到1999 年的19. 2 亿美元,预计到2002 年市场规模将达到25 亿美元.就酶在各领域的应用来说,食品、饲料工业用量最大,占销售总额的45 % ,洗涤剂占32 % ,纺织工业占11 % ,造纸工业占7 % ,化学工业占4 %.权威部门预测1997 年至2002 年,5 年中酶制剂市场的发展趋势,食品用酶将由7. 25 亿美元增至11. 76 亿美元,年增长率11. 4 %;洗涤剂用酶将由4. 89 亿美元增到8. 48 亿美元,年增长率13. 3 %;纺织用酶将由1. 65 亿美元增到2. 58 亿美元,增长率10. 3 %;造纸工业用酶将由1 亿美元增加到1. 92 亿美元,年增长率为最高,达到16. 2 %;化学工业将由0. 61 亿美元增加到0. 96 亿美元, 年增长率10. 5 %.与1985 年时,食品工业用酶占酶制剂市场62 % ,洗涤剂用酶占33 % ,制革纺织工业用酶占5 %相比,其明显的变化是,非食品工业用酶领域在迅速扩大,反映了人们对环保意识的增强.

在全世界上百个有名的酶制剂企业中, 丹麦NOVO 公司牢牢把持着龙头地位,占有50 %以上市场份额,杰能科则其次,占25 %左右市场份额,其它各国酶制剂生产企业分享余下的25 %市场份额.

工业上使用的酶制剂基本上分为二类:一类是水解酶类,包括淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、乳糖酶等,占有市场销售额的75 %以上.目前约有60 %以上的酶制剂已用基因改良菌株生产,NOVO 公司使用的菌种有80 %是基因重组菌株.第二类是非水解酶,占市场销售额10 %左右,并有逐年增大的倾向,主要是分析试剂用酶和医药工业用酶.

食品工业中,用于淀粉加工的酶所占比例仍是最大,为15 %;其次是乳制品工业,占14 %.酶在食品、纺织、制革工业等传统的应用虽然已相当广泛,技术上也已很成熟,但是仍在不断发展.以下就近年来对酶的生产安全与在工业应用方面的新发展作一简单介绍:

1 酶制剂生产的安全卫生管理

我国加入WTO 在即,对于酶制剂生产的安全卫生管理不可不加注意.食品用酶制剂国外是作为食品添加剂的,对其安全卫生规定很严.酶本身虽是生物产品,比化学制品安全,但酶制剂并非单纯制品,常含有培养基残留物、无机盐、防腐剂、稀释剂等.在生产过程中还可能受到沙门氏菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌之污染.此外还可能会含生物毒素,尤其是黄曲霉毒素,即使是黑曲霉,有些菌种也可能产生黄曲霉毒素.黄曲霉毒素或由于菌种本身产生或由于原料(霉变粮食原料) 所带入.此外培养基中都要使用无机盐,难免混入汞、铜、铅、砷等有毒重金属.为保证产品绝对安全,对原料、菌种、后处理等道道工序都要严格把关.生产场地要符合GMP(Good Manufactur2ing Practice 即良好的生产规程) 要求.对酶制剂产品的安全性要求,联合国粮农组织(FAO) 和世界卫生组织(WHO) 食品添加剂专家委员会(Joint FAO/ WHO Expert Committee on Foodadditives , J ECFA) 早在1978 年WHO 第21 届大会提出了对酶制剂来源安全性的评估标准:

(1) 来自动植物可食部位及传统上作为食品成份,或传统上用于食品的菌种所生产的酶,如符合适当的化学与微生物学要求,即可视为食品,而不必进行毒性试验.

(2) 由非致病的一般食品污染微生物所产的酶要求作短期毒性试验.

(3) 由非常见微生物所产之酶要作广泛的毒性试验,包括老鼠的长期喂养试验.

这一标准为各国酶的生产提供了安全性评估的依据.生产菌种必须是非致病性的,不产生毒素、抗生素和激素等生理活性物质,菌种需经各种安全性试验证明无害才准使用于生产.对于毒素之测定,除化学分析外,还要做生物分析.英国对添加剂的安全性是由化学毒性委员会

(简写COT) 进行评估的,并向政府专家咨议委员会FACE(食品添加剂和污染委员会) 提出建议.COT最关心的是菌种毒性问题,建议微生物酶至少做90天的老鼠喂养试验, 并以高标准进行生物分析.COT 认为菌种改良是必要的,但每次改良后应作生物检测.美国对酶制剂的管理制度有二种: 一是符合GRAS( General recognized as safe) 物质;二是符合食品添加剂要求.被认为GRAS 物质的酶,在生产时只要符合GMP 就可以.而认为食品添加剂的酶,在上市前须经批准,并在联邦管理法典(CFR , TheCode of Federal Regulation) 上登记.申请GRAS 要通过二大评估,即技术安全性和产品安全性试验结果的接受性评估.GRAS 的认可除FDA 有权进行外,任何对食品成份安全性具有评估资格的专家也可独立进行评估.在美国用以生产食品酶的动物性原料,必须符合肉类检验的各项要求,并执行GMP 生产,而植物原料或微生物培养基成份在正常使用条件下,进入食品的残留量,不得有碍健康.所用设备、稀释剂、助剂等都应是适用于食品的物质.须严格控制生产方法及培养条件,使生产菌不致成为毒素与有碍健康之来源

此外,近年来世界食品市场推行KOSHER 食品认证制度,即符合犹太教规要求的食品制度.有了KOSHER 证书,才可进入世界犹太组织的市场.在美国不仅是犹太人,连穆斯林、素食者、对某些食物过敏的人,大多数也购买KOSHER 食品.按规定KOSHER 食品中不得含有猪、兔、马、驼、虾、贝类、有翼昆虫和爬虫类的成份.加工KOSHER 食品的酶制剂同样要符合KOSHER 食品的要求.故国外许多食品酶制剂都有符合KOSHER 食品的标记.要将我国酶制剂向海外开拓,对此不可不加以注意.符合KOSHER 食品要求由专门权威机构审批,比FDA 还严.

2 酶在工业中的新用途

2. 1 功能性低聚糖的制造

近20 年来,以双歧杆菌、乳酸菌为主的益生菌和以低聚果糖、异麦芽糖、低聚半乳糖为首的益生原作为新一代保健食品在世界各国广泛流行.通过酶法转化的各种功能性低聚糖年销售量已超过10 万吨.功能性低聚糖是指那些人体不消化或难消化吸收的低聚糖,摄取后直入大肠,选择性地被人体自身的有益菌(双歧杆菌等) 所优先利用.使体内双歧杆菌成倍、上百倍地增殖而促进宿主的健康,故也称为双歧因子.这些低聚糖也不被龋齿病源突变链球菌所利用,食之不会引起蛀牙.每天摄取3～10 g 功能性低聚糖,可改善胃肠功能,防止便泌和轻度腹泻,减少肠内毒素生成和吸收,提高机体抗病免疫功能.功能性低聚糖正在成为21 世纪流行的健康糖源.

(1) 异麦芽低聚糖:是难消化低聚糖,不被唾液、胰液所分解,但在小肠可部分被分解和吸收.热值约为蔗糖和麦芽糖的70 %～80 %.对肠道直接刺激性较小.小鼠急性毒性试验LD50 为44g/ kg 以上,安全性不逊于蔗糖和麦芽糖.人体最大无作用量1. 5 g/ kg (摄取后24 小时不发生腹泻之上限量) ,而其它难消化低聚糖或糖醇的最大无作用量只有0. 1～0. 4 g/ kg.摄取异麦芽糖16g ,一周后肠道中双歧杆菌、乳酸菌等有益菌明显增加,而拟杆菌、梭状杆菌等有害菌受到抑制,便秘改善,粪便pH 下降,有机酸增加,腐败物减少.小鼠试验表明,摄取异麦芽糖后免疫力增强,血脂改善.异麦芽糖在高温、微酸性和酸性环境下稳定,可以添加于各种食品和饮料中.

异麦芽低聚糖是淀粉经α- 淀粉酶液化,β- 淀粉酶糖化和α- 葡萄糖苷酶转苷反应而生成的包括含α- 1 ,6 键的异麦芽糖,潘糖,异麦芽三糖等分枝低聚糖的糖浆.市场上的异麦芽糖分含量50 %与90 %两种,后者是将含量50 %的异麦芽糖用离子交换法或酵母发酵法去除葡萄糖而成.粉状糖是糖浆经喷雾干燥而成.

生产异麦芽糖的α- 葡萄糖苷酶是黑曲霉生产糖化酶之副产品,将糖化酶发酵液经离子交换吸附去除所含α- 葡萄糖苷酶经洗脱浓缩而成.虽然发表过不少培养黑曲霉生产α- 葡萄糖苷酶的研究的报道,但未见用于商品生产.用α- 葡萄糖苷酶转化麦芽糖生产异麦芽低聚糖,其生成量一般仅50 %左右,另外还含有20 %～40 %的麦芽糖与葡萄糖.为了提高异麦芽低聚糖产量,曾有不少研究报导,例如使用臭曲霉α- 葡萄糖苷酶,产品中潘糖产量可达30 %葡萄糖量可降至20 %.高崎发现脂肪嗜热芽孢杆菌所产普鲁兰酶在高浓度麦芽三糖存在下有转苷作用.将其结构基因导入枯草杆菌NA - 1 ,生产的新普鲁兰酶,与枯草杆菌糖化型α- 淀粉酶(可产生麦芽三糖) 一起作用于淀粉,异麦芽低聚糖的产率可达60 % ,而葡萄糖含量由40 %降至20 %.为了提高黑曲霉α- 葡萄糖苷酶的活力,东京大学生物工程系将α- 葡萄糖苷酶基因AGLA 导入黑曲霉GN - 3 ,得到转化子GIZ 155 - A3 - 4 ,产酶能力提高了11 倍.

目前我国生产异麦芽糖的企业多达50～60 家,生产能力约5 万吨以上,α- 葡萄糖苷酶的用量以0. 1 %计,需50 吨,消耗外汇甚巨(以每吨75 万元计,就需3750 万元人民币) .有必要立足自给.

(2) 海藻糖:是二分子葡萄糖以α,α- 1. 1 键连结而成的非还原性低聚糖.广泛存在于动植物和微生物(如菌覃、海藻、虾、啤酒酵母、面包酵母) 中,是昆虫主要血糖,作为飞翔时之能源来利用.海藻糖能保护某些动植物适应干燥和冰冻的环境.海藻糖是一种很好的糖源,因非还原性,故耐酸耐热性好,不易同蛋白质、氨基酸发生反应.对淀粉老化,蛋白质变性,脂肪氧化有较强抑制作用.此外还可消除某些食物之苦涩味、肉类之腥臭.海藻糖不被龋齿突变链球菌利用,食之不会引起蛀牙.活性干酵母的活存率全赖酵母细胞中海藻糖含量所决定.过去海藻糖系从酵母中提取(最大含量也只有20 %) ,成本甚高,每公斤高达2～3 万日元.现在可以用酶或发酵法生产,成本大大下降.久保田等从节杆菌、小球菌、黄杆菌、硫化叶菌等土壤细菌中发现一组海藻糖生成酶(海藻糖合成酶 MTSASE 与麦芽低聚糖海藻糖水解酶MTHASE) ,当将其同异淀粉酶、环糊精生成酶、α- 淀粉酶、糖化酶一起作用于液化淀粉时,可得到85 %收率的海藻糖.

(3) 帕拉金糖( Palatinose) 学名为异麦芽酮糖( Isomaltotulose) :以蔗糖为原料,经产朊杆菌或普利茅斯沙雷氏菌的α- 葡萄糖基转移酶(又称蔗糖变换酶Sucrose multase) 的作用,蔗糖分子的葡萄糖和果糖由α- 1 ,2 键结合转变为α- 1 ,6 键结合而成.由于结构的改变,其甜度减少到蔗糖之42 % ,吸湿性较低,对酸的稳定性增加,耐热性略为降低,生物学、生理学特性发生改变,不能为多数细菌、真菌所利用.食后不被口腔、胃中的酶所分解,直到小肠才可被酶水解成为葡萄糖和果糖而进入代谢.帕拉金糖不为口腔龋齿突变链球菌所利用,食之不易发生蛀牙,食后血糖也不会迅速升高,故可为糖尿病人使用.

帕拉金糖在低水份和低pH 下便会失水而缩合成为2～4 个分子的低聚帕拉金糖,甜度为蔗糖之30 % ,不为肠道消化酶所消化,食后可直达大肠而为双歧杆菌选择性利用,起到双歧因子的保健作用.将帕拉金糖在高温高压下,用雷尼尔镍为催化剂氧化便生成帕拉金糖醇.这种糖醇甜度为蔗糖的45～60 % ,热值为蔗糖的二分之一.食后不易消化吸收,不会引起血糖和胰岛素升高,不会引起蛀牙,适合糖尿病人、老人、肥胖者作甜味剂.因其物理性质酷似蔗糖,可用其制作低热值糖果,是国际上流行的新一代甜味剂.上述三种糖在欧美、日本等已经大量生产,并被广泛利用;而在国内虽已研究成功,但在生产和应用上尚存在不少阻力.

(4) 低聚果糖:是以蔗糖为原料经黑曲霉β2果糖基转移酶的作用,将蔗糖分子的D2果糖以β22 ,1 链连接123 个果糖分子而成的蔗果三糖、蔗果四糖以及蔗果五糖与蔗糖、葡萄糖以及果糖的混合物,甜度为蔗糖的60 %.用离子交换树脂将其中葡萄糖与果糖除去后,可得到含低聚果糖95 %以上的产品,甜度为蔗糖的30 %.低聚果糖的主要成份蔗果三糖与蔗果四糖在人体中完全不被唾液、消化道、肝脏、肾脏中的α2葡萄糖苷酶水解,本身是一种膳食纤维,食后可直达大肠,为大肠中的有益细菌优先利用.食低聚果糖不会引起血糖、胰岛素水平的升高,热值为1. 5kCal/ g ,通过双歧杆菌的增殖,肠道得以净化,肌体免疫力增强,营养改善,血脂降低.以年龄50～90 岁老人进行试验,日食低聚果糖8g ,8 天后肠道双歧杆菌可由5 %增加到25 %.便秘者食用低聚果糖每天5～6g ,4 天后80 %便秘者症状改善,粪便变为柔软,色泽转黄,臭味减少,肠道腐败得到控制.

低聚果糖也存在于菊芋、菊苣、芦笋等植物,西欧都用菊粉做原料,用菊粉酶局部水解而成.日本政府将低聚果糖批准为特定保健食品;西欧、芬兰、新加坡、台湾等地将低聚果糖作为功能性食品配料,广泛使用在各种食品.我国大陆低聚果糖的年生产能力为15000 吨,广东江门量子高科10000 吨,云南天元3000 吨,张家港梁丰1000 吨,广西大学奥立高500 吨.此外五粮液酿酒公司、上海中科生物医学高科技开发有限公司也在销售.

(5) 低聚木糖的特点是对酸、热稳定性强,故可用于果汁等酸性饮料,因其不被多数肠道细菌利用,只有双歧杆菌等少数细菌能利用,因此是一种强力双歧因子,每天摄取0. 7g 即可见效.这种糖是以玉米芯为原料,提取其木聚糖后,用曲霉木聚糖酶水解而得.由日本三得利公司首先生产,我国山东龙力公司在中国农大的支持下开发成功.山东食品发酵研究院亦已宣告研制成功.此外,其它功能性低聚糖如低聚半乳糖,低聚甘露糖等我国也已开发成功.

2. 2 酶用于功能性多肽的生产

近年发现蛋白酶水解蛋白质生成的肽类,其吸收性比蛋白质或由蛋白质的组成的氨基酸为好,因此可作为输液、运动员食品、保健食品等.在蛋白质水解物中,有些肽具有生理活性功能,如酪蛋白经胰酶或碱性蛋白酶水解可生成酪蛋白磷酸肽(CPP) ,具有促进Ca 、Fe 吸收的功能.由鱼肉、大豆、酪蛋白经酶水解得到的水解物中含有一种氨基酸,序列是Ala - Val - Pro - Tyr - Pro - Gln - Arg 的七肽,是一种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI , An2giotensin Converting Enzyme Inhibitor) .它可同血管紧张素相结合影响其活性的表达,从而防止血压升高,是较理想的降压保健食品.由不同蛋白质原料,不同的蛋白酶水解得到不同结构的肽类中,有些肽还具有降血脂,促进酒精代谢、抗疲劳、抗过敏的生理功能.常食豆酱、豆豉、纳豆、乳腐等酿造食品有益健康,原因也在此.胨是细菌培养基原料,因发现其有生理功能,竟

然也有人将它装入胶囊,当保健品销售,获利甚丰.

2. 3 酶用于油脂工业

酶在油脂工业上的应用还处于萌芽阶段.(1) 纤维素酶、半纤维素酶用于榨油工业:油料用溶剂抽提油后,残渣中残留溶剂很难完全去除,影响饲料应用,为此日本开发了采用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶分解植物组织,来提取油脂.方法是将油橄榄、菜籽等先经破碎或热处理,然后加半纤维素酶反应数小时,离心分离油脂和渣粕.这种工艺已用在橄榄油、桔油提取上,菜籽油已进入中试阶段.在动物油脂生产上,利用蛋白酶处理,使蛋白质同油脂分离,因可避免高温处理,油脂的质量也就更好.为了去除油脂残余卵磷脂,使用磷酸酯酶去除油中水溶性卵磷脂.

(2) 制造脂肪酸

脂肪酶对底物有位置专一性和非专一性之分,此外对底物脂肪酸链长、不饱和度也有选择性,用对位置无专一性脂肪酶水解猪油生产脂肪酸,作为制造肥皂的原料.用对不饱和脂肪酸酯无作用的脂肪酶,水解鱼油时,因对高度不饱和脂肪酸DHA 的甘油三酯难水解而保留下来,用此法来制造DHA 等ω3 脂肪酸.

(3) 酯交换

利用脂肪酶之酯交换作用,改变油脂脂肪酸组成可改变油脂性质,例如用棕榈油改性成为可可脂.

2. 4 转谷酰胺酶( TGASE) 用于肉类加工转谷酰胺酶可催化蛋白质分子中谷氨酸残基上γ2酰胺基和各种伯胺间的转酰基反应,当蛋白质中赖氨酸残基的ε2氨基作为酰基受体时,可在分子间形成ε2(γ2Gln) Lys 共价键而交联,从而可增加蛋白质之凝胶强度,改善蛋白质结构和功能性质,利用此作用,可将低值碎肉重组,改善鱼、肉制品外观和口感,减少损耗, 从而提高经济价值.还可将Met .Lys. 等必须氨基酸导入缺乏此氨基酸的蛋白质而改善营养价值.此酶也可用于毛织物加工,用于酶的固定化或将不同分子进行联结,将抗体与药剂进行联结等.生产菌种为茂原链轮丝菌( S t reptoverticill ummobaracens) ,日本已商业化生产,我国无锡轻工业大学也已研究成功,转入试生产阶段.

2. 5 酶在果蔬加工上的新用途

(1) 原果胶酶用于果胶提取:

果实中的果胶在未成熟前是以不溶性的原果胶形式存在的,在水果成熟过程中逐渐转变成可溶性之果胶.原果胶也可在酸、热作用下转变为可溶性.由枯草杆菌、黑曲霉、酵母、担子菌所生产的原果胶酶已被开发用于桔皮、苹果、葡萄皮、胡萝卜中果胶的提取.用酶法提取果胶与酸热法相比工艺简单,无污染,成本低,产品质量除含糖量稍高外,无甚区别.

(2) 粥化酶(Macerating enzymes) 之用于提高果

汁得率:

粥化酶是果胶酶、半纤维素酶(包括木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶) 、纤维素酶之混合物,作用于溃碎果实,对促进过滤,提高果汁收率的效果比单一果胶酶为好.已是果汁加工主要的酶.

(3) 真空或加压渗酶法处理完整果蔬:

利用加压或真空浸渍果蔬,使果胶酶渗入细胞间隙或细胞壁中而起作用.此法已用于完整桔子的软化,桔皮容易剥除.还用于桃肉硬化处理,将果胶甲基酯酶与 Ca2 + 渗入桃肉,可使罐头糖水桃子硬度提高4 倍(因脱甲酯之果胶可同Ca2 + 结合而增强硬度) .腌制蔬菜用此法处理可防止软化而保持脆性.此法也用于桔皮之柚苷酶脱苦处理, 脱苦率达81 %.

(4) 柒酶用于去除酚类化物

澄清果汁经超滤过滤,浓缩后仍发生白色混浊,此乃由于果汁中酚类化合物所引起,为此在过滤前可用柒酶处理,使之氧化聚合成不溶性高分子而过滤去除之.

(5) 果胶酶用于洗清滤膜果胶污染物.

(6) β2葡聚糖酶用于去除葡萄汁中由感染Cot rytis cinerea 而产生的β- 葡聚糖,Vinozyme促使不溶物沉降.

2. 6 酶在纺织工业上的应用

棉布用淀粉酶退浆已有100 多年历史了,随着酶制剂工业的发展,纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、柒酶、蛋白酶等酶类先后被纺织工业所采用.

(1) 棉布整理用酶

随着牛仔服的流行,纤维素酶整理棉布,改善织物观感和手感,已受到纺织业的广泛重视.纤维素酶作用于天然纤维非结晶区,使纤维发生部分降解和改性,可使织物柔软、光洁、手感和外观舒适.通常用酶处理以后,棉布重量减轻3～5 % ,但牢度要损失20 %左右.在发达国家为追求时尚,不在乎布的牢度.

过氧化氢酶常用于经H2O2 漂白后除去残留的H2O2 , 最近发现A rthromyces ramosus , 鬼伞菌Coprinus cinereus可大量生产过氧化氢酶,过氧化氢酶也用于洗涤剂.果胶酶用于棉布整理,主要是分解棉、麻织物纤维表面的果胶,以利漂白与染色.柒酶是种酚氧化酶,以O 为H 受体,主要用在牛仔布靛蓝染色时脱色处理,NOVO 公司采用基因技术改良黑曲霉生产.柒酶也可作用于木质素,有分解木质素的作用.木聚糖酶用于布坯漂白处理,可去除木质素及粘附纤维上之棉子壳.

(2) 毛织物蛋白酶防毡缩整理

毛织品若不经整理水洗后便发生收缩毡化不能再穿(如劣质羊毛衫洗涤后缩得很小) ,必须防缩防毡化处理,洗后才能保持原状.防毡化防腐处理已有100 多年历史,过去用氯、H2O2 、过硫酸盐处理,污染严重,90 年代才开发了无氯防缩剂.利用蛋白酶改变羊毛结构可用于防毡防缩处理,40 年代就有人研究,60 年代日本报道,用木瓜酶处理可防毡缩,并可进行低温染色,提高染色率,减少污水,改善毛织物手感和观感.70 年代我们也曾试用酸性蛋白酶处理,进行低温染色,取得良好结果,染色率提高3. 6 % ,污水减少62 %.每千锭断纱率降到145 根,抗伸力、抗拉力、手感都有明显提高.80 年代以来,酶法防毡缩在国内外重新引起重视,日、英、美等国发表了大量研究文章,取得了一定进展.研究过的蛋白酶有胰酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等,相信不久这些工艺会成熟而得到推广.

2. 7 酶在造纸工业上的应用

造纸工业是环境污染的重要源头.随着人们对环保意识增强,造纸工业使用生物技术受到了重视.酶法生产纸浆引起了各国浓厚兴趣,关键是降解木质素.最近国内有人利用多种微生物作用制造纸浆,已经取得可喜进展,目前正在筹备扩大试验.酶在造纸工业的应用现在主要是脂肪酶用于原木脱树脂,纤维素酶半纤维素酶和脂肪酶用于废报纸回收后脱油墨;以及木聚糖酶用于纸浆漂白.

(1) 原木脱树脂:

造纸用的原木因含树脂,打浆抄纸时,树脂污染设备,影响生产,降低纸品质量.为此需要在室外堆放很长时间(3 个月以上) ,使树脂分解.这样影响生产周期,还占用大片场地.日本造纸研究机构对原木成份进行研究,发现树脂的成份中96 %是油酸和亚油酸,使用脂肪酶处理就可除去.自从90 年代在生产上采用后,纸品的质量提高,原木堆积成本下降,树脂吸附剂用量减少,经济效益提高.当时所用脂肪酶由NOVO 公司供应,在pH6～10 ,40～60 ℃作用良好,近来又发现使用耐热性70 ℃的脂肪酶效果更佳.

(2) 纸浆漂白:

纸浆为了除去色素来源木质素,要用氯、次氯酸、二氧化氯等氯化物处理,污染严重,因此60 年代就有人考虑用木质素酶将其分解.木质素是以苯基丙烷为骨干的高分子聚合物,只有将其分解木质素才会崩解.已发现对木质素有分解力的酶有木质素过氧化酶 (L IP) 、锰依赖性过氧化酶(MNP) 、柒酶(LAC) ,但至今未找到适用的木质素酶.近年芬兰提出了一种化学和酶法相结合的处理法,取得了较好的效果.先用木聚糖酶切断木质素同纤维素之间的联系物(木聚糖和半纤维素) ,使木质素游离,再用碱蒸煮后,由纸浆游离出的木聚糖可再次吸附在纤维的表面,用木聚糖酶将其分解,可增加孔隙,于是氯素的浸透性提高,并使木质素容易从纸浆内部出来,此工艺活性氯用量可减少30 %.

(3) 废报纸回收利用中的脱墨

废纸回收后打纸浆时,需用碱、非离子表面活性剂、硅酸钠及H2O2 进行脱墨处理.日本在脱墨时添加碱性纤维素酶、半纤维素酶0. 1 %反应2 小时,抄纸白度可提高4～5 % ,强度并未降低.由于防止油墨印刷品弄脏手,油墨中加有亚油酸、亚麻酸和油酸等的高级三甘油酯,故脱墨时再添加脂肪酶效果更好,白度可提高2. 5 %.废报纸脱墨,我国山东大学也进行过不少研究.

2. 8 其它

植酸酶除作为饲料添加剂用以提高饲料中有机磷的利用率,减少粪便中磷对环境的污染,节省饲料另加磷酸盐用量.近年植酸酶还用于酿造,以改善原料中磷的利用,以及用于去钾大豆蛋白食物的生产,成为肾脏病人蛋白质的来源.α- 葡萄糖基转移酶还用于甜叶菊加工,用以脱苦涩味.淀粉的液化和糖化几乎占了工业上酶反应的绝大部分,由于目前的酶液化、糖化要在不同pH 和温度下进行,为简化工艺、节省水和能源,有必要开发耐酸性高温α2淀粉酶和耐热性糖化酶,如果α2淀粉酶可在pH4. 5 时进行液化,而糖化酶能在60 ℃以上温度下进行,试想将这些带来多大的效益? 不仅如此在pH4. 5 液化,还可避免麦芽酮糖生成.耐酸性α2淀粉酶和耐热性糖化酶在国外已经进行多年研究,已有不少报道.例如日本报道已选育出一株耐酸性α2淀粉酶( KOD - 1) ,在30 %淀粉浆中,pH4. 5 ,105 ℃下反应10 分钟,残留酶活75 %.将该酶在pH4. 5 ,60 ℃时液化30 %粉浆60 分钟,得到DE14 液化液,加糖化酶0. 1 %糖化48 小时,葡萄糖含量达95. 5 % ,与对照枯草杆菌α2淀粉酶的结果于pH5. 8 液化者相同(葡萄糖含量95. 7 %) .此外,利用蛋白质工程将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶分子中7个蛋氨酸用其它氨基酸置换后,耐酸性增强.这类酶的产业化一旦成功,将大大改变糖化有关工业的面貌.

3 结束语

随着世界能源的日益减少,而人口却在不断增加,水资源和粮食日见短缺.由于人类对环保意识的加强,使得工业界用酶来改革传统工艺的需求更为迫切.因此,提高酶的产量,降低生产成本,开发酶的新品种、新用途更是当务之急.基因工程、蛋白质工程的发展,为酶制剂工业发展创造了有利条件.开发耐热、耐酸碱,对底物有特殊作用的酶,以及将动植物生产的酶改由微生物发酵方法来生产,或者将还不能使用的微生物所产的酶改由安全菌种来生产,都将成为现实.