流式细胞仪工作原理（流式细胞术原理）

本文目录一览：

• 1、流式细胞术，你这磨人的小妖精
• 2、请教流式细胞术PI染色进行细胞周期分析的原理
• 3、流式细胞仪为何要对样品进行荧光标定
• 4、流式细胞仪的原理是什么？
• 5、流式细胞仪检测的原理
• 6、流式细胞术原理

流式细胞术，你这磨人的小妖精

流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。

一、小妖精的成仙之路

二、样本类型

流式细胞仪可检测多种样本：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞、微生物。

三、工作原理

流式细胞仪主要由3部分组成：液流系统、光学系统、电子系统。进行荧光染色后的待测细胞会在一定气体压力下被压入流动室，在鞘液的包裹下待测细胞呈单行排列，依次通过检测区域，被荧光染色的细胞在激光束的照射下会产生散射光和激发荧光。这两种信号会同时被光电倍增管( PMT) 接收。接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

四、流式细胞术的应用

五、操作过程中的注意点

1、上机前处理

小心荧光淬灭

操作时必须严格按照孵育时间，如果抗体孵育时间过长，荧光是会逐渐淬灭的。那如果不得不推迟实验怎么办？可以把试管放在冰里面，这样会稍稍延长淬灭的时间。

注意染色顺序

在进行多荧光染色的时候，相同的细胞会因为染色顺序不同而导致荧光强度的差异。解决办法为：预实验。做一系列的不同染色顺序的样本，通过对染色前和染色后的各种样本进行比较分析，判断染色顺序对细胞造成的影响。

选好染色方案

染色方案不合理也可能会导致荧光染色信号太弱。解决的方案：预实验。在正式开始实验之前，通过预实验，设计出一个完美的染色方案。（考虑试剂种类，试剂质量，试剂用量，孵育时间，洗涤次数，染料浓度，染色时间及染色温度等其他因素。）

做好阴性对照及同型对照试验

细胞阴性对照可以显示细胞基准的荧光水平。

同型对照则是为了查看抗体非特异性结合的水平。选择同型对照需要注意采用相同物种、相同亚类、相同染料、相同浓度，否则，检测的时候会出现乱七八糟的同型对照结果。

选择合适的抗体

通用原则是：为表达最弱的抗原选择染色指数最高的荧光素。根据使用的流式细胞仪性能、激光器、滤光片种类来选择。对于多色实验，需选择发射光谱重叠小的染料。

2、参数设定

数据的获取必须是在仪器性能的校准均合格的基础上进行。仪器散射光和荧光信号的光电倍增管电压、增益、颜色补偿等参数的设定会直接影响结果。

电压

电压的调节需根据阴性对照管来调节。

阈值

可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值；大多数样本都可以设定FSC/SSC；阈值以下的信号不存储；可以根据阴性对照管来调节。

目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞信号等扣除，使收集到的都是有用信号。

补偿

流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。荧光补偿则可以从探测器种除去匹配荧光以外的任何荧光信号。

补偿方式：任意两个通道之间都可以调节。

补偿的调节：根据单染对照管来调节。

六、数据分析

流式细胞仪分析细胞的各种参数都是通过光信号来实现的。光信号包括了散射光信号和荧光信号。散射光信号包括前向角散射（FSC，反应细胞的大小）和侧向角散射（SSC，反应细胞颗粒度）。荧光信号可以用来反应细胞的抗原表达等化学特性。

流式图的种类非常多，最常用的是流式直方图和流式散点图。

直方图

流式直方图只能显示一个通道的信息。

横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。

散点图

X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。

FSC和SSC是流式中两个非常基本的参数，FSC的值能代表细胞的大小，细胞的体积越大，其FSC就越大。SSC则代表细胞的颗粒度，细胞内细胞器和颗粒度越大，则SSC越大。分析外周血细胞时，就可以利用FSC和SSC的特性把细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞（左图）。

右图中可以看到X轴为CD3，Y轴为CD4，四个象限表示：左上是CD3-CD4+，左下是CD3-CD4-，右上是CD3+CD4+，右下是CD3+CD4-。

等高线和密度图

等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。

密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞越少。

三维图

请教流式细胞术PI染色进行细胞周期分析的原理

实验原理：流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。

流式细胞仪为何要对样品进行荧光标定

这个是流式细胞仪的工作原理决定的。流式细胞仪用激光激发荧光素，再检测所发出的荧光。所以一般都是用荧光素标记的抗体或者荧光素直接染色，这样才能有特异性的信号。

流式细胞仪的原理是什么？

我简单说一下：\x0d\x0a1.首先，机器吸取细胞混悬液，射入由鞘液（一般都是磷酸盐缓冲液）。由于鞘液的流速大，所以细胞混悬液通过轴流的形式在中央，一般是单个细胞排队的形式。\x0d\x0a\x0d\x0a2.然后细胞通过检测窗口。有激光束照射。一般细胞都经过荧光染色，被激光照射后，会有不同波长的激发光产生。机器设有检测器来探测激发光的强弱\x0d\x0a\x0d\x0a3.根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果（比如抗原量，DNA量，等等）

流式细胞仪检测的原理

很简单的啊。

流式细胞仪数据分析

5.1 数据采集及显示

光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。

根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。 4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。

数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图

双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。

习题：数据采集及显示

1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 。

2 二维点图用于显示 参数。

3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 。

5.2 设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图

习题：设门

1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错）

5.3 细胞亚群的数据分析

数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。

图5-3 选定淋巴细胞亚群设门

门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。

图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。

图5-5 直方图统计结果

二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。

图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。

图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。

图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果

这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。

图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比

5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析

这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。 如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。

图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。

QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。

图5-13 细胞周期的DNA直方图

习题：数据分析

1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？

2 见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。

3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对 错）

4 见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。

5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对 错）

6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。

7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。

8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。

5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用

CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。

1．软件数据流程

在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。

数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI。

2.软件与仪器的连接

流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。

1、 先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。

2、 在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件。

3、 从Aquire菜单下选择connet to cytometer。

3．方案与数据之间的关系

CellQuest和CellQuest Pro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。

当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；

当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。

当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。

所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。

CellQuest Pro CellQuest

4．方案的建立

A选择实验参数

默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。

B,建立散点图或直方图，命名坐标

CellQuest Pro软件主要工作界面，软件类似于Office word的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。

在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。

建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。

在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC，FL2为CD4PE……。

C,设门并建立门与图之间的关系

R与G的关系

R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：

Gate实际了个代数式，简称G，其运算式默认如下：

G1 = R1，或G2=R2

当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2。此时G1就成了一个算术结果了。

G1=R1 AND R2

G2=R1 NOT R2

G3=R1 OR R2

Region List管理门，可以重命名或删除门。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。

建立门与图之间的关系

打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。

D，显示统计参数

5．仪器的操作

当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：

在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：

6．文件的保存及调用

实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件：

如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性），有两种方案打开以往的数据：

方法一：选择直方图或散点图，打开该图的属性框（Plot-Format），见下图：

在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。

方法二：选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择Chang Data File，打开要分析的数据包。

附：CellQuest Pro软件所有下接菜单

流式细胞术原理

流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。

光源、液流通路、信号检测传输和数据的分析系统是流式细胞仪的主要组成。临床中运用流式细胞仪进行外周血白细胞、骨髓细胞以及肿瘤细胞等的检测是临床检测的重要组成部分。

流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。

基本结构：流式细胞仪由三部分构成：液流系统，包括流动室和液流驱动系统；光学系统，包括激发光源和光束收集系统；

电子系统，包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。

用于FCM的样本是单细胞悬液，可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。