骨髓间充质干细胞分化实验要用第几代细胞（骨髓基质干细胞和间充质干细胞）

2023-01-08 03:54:08 作者：max

本文目录一览：

1、鸡骨髓间充质干细胞加入巨噬细胞集落刺激因子后是分化成巨噬细胞还是M2型巨噬细胞呢
2、骨髓间充质干细胞表面标志物cd45是单标还是双标
3、骨髓间充质干细胞可以用DMEM/F12养吗
4、归肾丸水提物干预SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及PI3K、AKT蛋白的表达
5、骨髓间充质干细胞三系诱导分化技术

鸡骨髓间充质干细胞加入巨噬细胞集落刺激因子后是分化成巨噬细胞还是M2型巨噬细胞呢

单核细胞来源粒--单系祖细胞，经原单核细胞、幼稚单细胞阶段分化成单核细胞，然后由骨髓释放入血，在血中3~~4天后进入组织和浆膜腔转变成巨噬细胞。二者是相同但在部位不同名称不一样，共同构成单核巨噬细胞系统。单核-巨噬细胞系统包括血液中巨噬细胞\干细胞\骨髓单核细胞来源粒--单系祖细胞，经原单核细胞、幼稚单细胞阶段分化成单核细胞，然后由骨髓释放入血，在血中3~~4天后进入组织和浆膜腔转变成巨噬细胞。二者是相同但在部位不同名称不一样，共同构成单核巨噬细胞系统。单核-巨噬细胞系统包括血液中

骨髓间充质干细胞表面标志物cd45是单标还是双标

不同的干细胞有自己特异的细胞表面抗原，鉴定细胞的种类最准确直接的方法就是用流式细胞仪检测其表面抗原。

以骨髓间充质干细胞（MSC）为例，需要鉴定CD34、CD44、SH1等表面标志。除此之外，骨髓间充质干细胞还需要进行分化实验，以证实其可以分化为骨、软骨、细胞。以上两条，即表面标志及分化实验没有问题，就可以确定培养的细胞为骨髓间充质干细胞。

不同的干细胞有不同的表面标志及分化能力，所以MSC只是做为一个例子来说明。

骨髓间充质干细胞可以用DMEM/F12养吗

DMEM-F12是适于各类干细胞培养的基础培养基，按不同目的还需要你补加其它东西。看到丁香园里的很多人都是那这个养BMSC的，应该没问题。

但也有人说DMEM/F12容易导致细胞分化，所以个人建议最好使用低糖培养基。

归肾丸水提物干预SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及PI3K、AKT蛋白的表达

摘要：

归肾丸：归肾丸原方出自《景岳全书》，全方由熟地、杜仲、山药、枸杞子、菟丝子、茯苓、当归、酒萸肉8味药组成，有补肾填精、调理冲任的功效，常用于治疗妇科疾病。作者采用纯水煎煮的方法获取归肾丸，所制得的归肾丸冻干粉1 g含生药量约为5.2 g。

原代骨髓间充质干细胞：原代细胞是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，传代前保持原有细胞的基本性质，通常把第1代至第10代以内的细胞统称为原代细胞。该实验从3周龄雄性SD大鼠的双侧股骨骨髓获取原代骨髓间充质干细胞，经200目筛网过滤后，用全骨髓贴壁法纯化，经鉴定后选取纯度和增殖能力均较高的第3代细胞进行后续实验。

背景：补肾类方剂对骨髓间充质干细胞的促增殖作用已经被证实，但其作用机制尚不明确，该研究以归肾丸为例，探讨其可能的作用机制。

目的：通过观察归肾丸水提物对骨髓间充质干细胞增殖的影响，探究归肾丸滋补肾精与骨髓间充质干细胞增殖之间的关系。

方法：从3周龄雄性SD大鼠股骨骨髓中分离提取骨髓间充质干细胞，采用全骨髓贴壁法将其纯化，选用纯度较高的第3代细胞进行药物干预，将其分为空白对照组和10，20，40，80，100 mg/L归肾丸水提物组，在体外连续培养5 d以观察量效关系和时效关系。倒置显微镜下观察细胞形态，CCK-8法评估细胞增殖活性，Western blot检测细胞中PI3K、AKT蛋白表达。

结果与结论： ①归肾丸水提物组的细胞增殖能力明显高于空白对照组，存在一定的量效和时效关系，尤以 80 mg/L归肾丸水提物干预3 d时作用效果最佳；②归肾丸水提物组骨髓间充质干细胞中PI3K、AKT蛋白的表达明显高于空白对照组；③结果提示，归肾丸水提物能有效促进骨髓间充质干细胞的增殖，可能与其参与调控PI3K/AKT信号通路有关。

ORCID: 0000-0003-0720-4797(刘燕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 归肾丸, 细胞增殖, PI3K, AKT, 滋补肾精

文章来源: 刘燕, 关永格, 宋阳. 归肾丸水提物干预SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖及PI3K、AKT蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(13): 1983-1988.

骨髓间充质干细胞三系诱导分化技术

1.1 接种干细胞

取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至培养器皿，于37°C,5%CO2培养环境下培养至汇合度90~100%，弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液。NOTE:如细胞贴壁性较差，建议使用0.1%明胶对培养底面进行包被。

1.2 细胞分化诱导

于37°C, 5%CO2培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基诱导液，继续培养3天。按照以上换液频率诱导14~21天,并注意观察细胞形态变化。根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面,室温固定30~60min,弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 油红0染色

取生理盐水或1xPBS与油红O原液配制油红0工作液(油红0原液:生理盐水=3:2)，现用现配。配制后可对油红0工作液进行离心，以沉淀染色液中的过饱和析出物。向清洗干净的诱导孔内加入适量油红0工作液,静置染色30min。吸走油红0工作液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，脂滴与油红0染料结合后呈现红色或橘红色。NOTE:干细胞的成脂分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。

1. 细胞分化诱导

将对数生长期的细胞消化下来计数，成软骨诱导分化培养基诱导液重悬细胞，离心后调整细胞密度密度1.0~2.0x 10e7cells/mL。吸取20 μl细胞悬液(约2.0~4.0x 10e5个细胞)悬滴至24孔板中央。置于37°C， 5%CO2培养环境下培养2~3 h使细胞贴壁。2~3 h后补充1 mL成软骨诱导分化培养基诱导液正常培养。每隔2~3天换液一次。按照以上换液频率诱导21~28天，并注意观察细胞形态变化。

2. 染色鉴定

2.1 细胞固定

吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去.后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30~60min后，弃去固定液再使用1xPBS清洗两次。

2.2 阿利辛蓝染色

向清洗干净的诱导孔内加入适量染色液，避光静置染色30min。吸去阿利辛蓝染色液，用1xPBS清洗两次,并加入适量1xPBS避免细胞干燥。

2.3 诱导评估

显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。

1. 干细胞的准备

将对数生长期的细胞消化下来计数，取3x 10e5个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4 min。弃上清,加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基预混液，重悬细胞，150g 离心5min。小心弃去.上清，加入0.5 mL成软骨诱导分化培养基诱导.液，重悬细胞，150 g离心5 min。将15 mL离心管的管盖稍稍旋开，放置于37°C，5% CO2培养环境下培养。

2. 细胞分化诱导

24h后观察细胞沉淀形变团聚的情况，如有明显的变化，则小心轻柔地拨动管底，尝试让细胞团脱离管底，全部浸润在诱导液中。

置于37°C, 5% CO2培养环境下培养约21天，通常每2天更换一次新鲜配制的成软骨诱导分化培养基诱导液。注意观察细胞团成球情况及表面光滑度，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。

3. 染色鉴定

3.1 软骨球固定

将软骨球从离心管中转移至EP管,并使用1xPBS清洗两次，最后置于适量的4%中性甲醛溶液中。

3.2 石蜡包埋切片

软骨球经石蜡包埋后切片。

3.3 阿利辛蓝染色

将石蜡切片脱蜡和脱水，使用阿利辛蓝染色液染色30 min，用自来水冲洗2 min,蒸馏水冲洗1次。

3.4 诱导评估

显微镜下观察成软骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，软骨组织中的内酸性粘多糖可被阿利辛蓝染成蓝绿色。