外泌体抗体沉淀试剂盒（组织外泌体提取试剂盒）

2023-01-09 03:58:30 作者：max

本文目录一览：

1、外泌体提取策略
2、再生医学材料的黄金搭档：外泌体与细胞外基质
3、外泌体细胞保存液是做什么的？
4、如何从尿液中快速、大量提取高质量、高纯度的外泌体？
5、New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles
6、求教有了解思路迪诊断外泌体蛋白辅助诊断早期卵巢癌项目的吗？简单介绍下

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从上清液中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1 聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加缓冲液冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5 ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体活检中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。

外泌体抗体沉淀试剂盒（组织外泌体提取试剂盒）

再生医学材料的黄金搭档：外泌体与细胞外基质

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外泌体的概念

上世纪80年代，外泌体首次被科学家发现，并且在很长时间内被认为是细胞的代谢产物。由于当时分析和研究的手段受限，外泌体的功能并不明晰。直到21世纪，科学家们才通过各种新技术，分离和提取出外泌体，并发现外泌体在细胞之间充当重要的沟通介质，进而影响细胞而至组织的生理活动。

细胞可以通过分泌细胞外囊泡与临近细胞或者远端细胞进行通信，而外泌体正是其中一类尺寸小于200纳米的细胞外囊泡。外泌体是在多泡核内体或多泡体中产生的，并在这些囊泡与质膜融合时分泌。外泌体由与细胞类似的磷脂双分子层组成，该双分子层含有跨膜蛋白和胞质蛋白和RNA；外泌体的内部包含一系列蛋白质（胞质、骨架和生长因子）和传递特定功能线索的miRNAs。因此，外泌体可以通过其表面的磷脂双分子层上蛋白靶向到受体细胞。外泌体一旦附着在靶细胞上，可通过受体-配体相互作用诱导信号转导，或通过内吞和/或吞噬作用内化，甚至与靶细胞的细胞膜融合，将其内容物传递到靶细胞的胞质中，从而改变受体细胞的生理状态。外泌体具有良好的生物相容性，不易在机体内引发免疫排斥反应。

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外泌体的提取

所有的细胞都可以分泌外泌体，机体的体液内和间质中均含有大量的外泌体。由于生物体内所含有的细胞或者蛋白非常丰富，因此从体内提取外泌体是非常困难的，而且外泌体来源的细胞也无法确定。

现如今有两类广泛使用的用于提纯外泌体的方法：超速离心法和Thermo Fisher等公司生产的提纯试剂盒。

超速离心法，主要是通过将实验室培养干细胞所得到的培养基通过滤膜滤掉尺寸较大的细胞碎片及细胞外囊泡后，通过超速离心机在100,000g的离心力的作用下富集得到外泌体。

提纯试剂盒，主要是通过试剂包被外泌体，使其尺寸和重量增大，从而在10,000g的离心力即可得到外泌体。试剂盒的使用有导致外泌体污染的风险，在科研领域超速离心法更为常见。

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外泌体的生物学特性

由于外泌体在再生医美领域显示出极大前景，这也迎来产业化合作的新浪潮，眼下外泌体似乎已经成为下一个生物医药的黄金赛道。科学家们普遍认为，外泌体具有其独特的生物学特征，可以反映来源细胞的表型。

图 5 外泌体促进皮肤修复

不同细胞分泌不同的外泌体，因此外泌体的应用是多种多样的。一方面，外泌体被认为是多种癌症的疾病诊断生物标志物。外泌体独特的miRNA谱图和疾病载体作用，使得其频繁出现在卵巢癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌和结肠癌。另一方面，外泌体也可以作为细胞信号传导的有效媒介而广泛用于医学再生领域。例如，它们能够将RNA和蛋白质的信息从来源细胞转移到周围环境中的其他细胞。实验证明，来自小鼠胚胎干细胞的外泌体在体外促进了小鼠造血干细胞的存活和扩展，同时也上调了受体细胞中与多能性相关的转录因子。干细胞来源的外泌体与生物材料相结合，促进骨组织以及关节软骨的修复和再生。

在皮肤组织再生中，外泌体的应用尤其广泛。如脂肪源外泌体能通过减少IFN-α的分泌而发挥免疫抑制作用，从而抑制T细胞的激活。此外，外泌体含有免疫调节蛋白如TNF-α、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），从而通过良好的炎症调节保证了伤口愈合。而在皮肤愈合过程中，外泌体则能通过优化成纤维细胞特性加速皮肤伤口愈合。在一项研究中发现，外泌体上调199个miRNA，下调93个miRNA，促进真皮成纤维细胞增殖和分化，加速皮肤再生。

图 6 外泌体促进皮肤细胞增殖

总而言之，干细胞来源的外泌体作用广泛。在皮肤再生中，外泌体可以通过调控炎症、促进皮肤修复等多方面提供作用；在疾病发展中，外泌体也参与多种病理通路。在未来，无论是组织再生、皮肤修复、还是疾病研究，外泌体都将在其中扮演重要角色。

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外泌体的缺陷

外泌体具有诸多优点，在医用再生中具有难以忽视的价值。然而，外泌体的应用却还有所局限。

最适用于提纯外泌体的超速离心法，在提纯得到外泌体的过程中会导致大量的外泌体损失，至少80%的外泌体会因为收集的损失或者在超离过程中其独特的磷脂双分子层的膜破碎而无法维持其正常形态。

此外，外泌体在提纯后其保存比较困难，需要保存的试剂具有与体液类似的渗透压从而维持其磷脂双分子层的膜结构，否则其内含的具有生物功能的蛋白质和miRNAs也容易失去活性。另外，外泌体起到信号传导作用，但本身并不会提供结构支持。因此，在修复领域，外泌体难以单独使用。

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细胞外基质：外泌体的最佳搭档

所有细胞均可分泌外泌体，外泌体充当着细胞之间信息交流的介质，因此外泌体生理功能的实现是通过一个细胞“出”而“进”入到另一个细胞内。在组织内部，必然要穿越细胞外基质。

因此，外泌体更适合作为细胞外基质的一部分来发挥价值，而细胞外基质的独特生理结构和生理稳态一来可以帮助维持外泌体的活性、二来也能与外泌体协同作用，实现更好的修复和再生效果。

细胞外基质是外泌体最理想的载体

在医用再生领域，科学家们研究各种各样的生物材料，并与外泌体进行复合促进组织的修复和新生。细胞外基质无疑是最安全的并且可以与外泌体协同发挥作用的生物材料。细胞外基质本身即源于人体，具有多元的组成（胶原蛋白、弹性蛋白、层黏连蛋白等等）。

一方面，细胞外基质能够起到结构支持作用，作为承载材料提供组织再生的根基；另一方面，细胞外基质中复杂的结构和靶点可以维持外泌体的活性，从而高效发挥外泌体的性能。外泌体可以通过进入细胞内发挥其优异的生物学功能，而细胞外基质作为载体即可以为细胞的黏附和迁移提供平台。如果没有细胞外基质所提供的平台，那么外泌体会很快随着体内的生理循环和代谢而流失，从而失去了其作用效果。众所周知，外泌体价格昂贵。当外泌体由细胞外基质承载、由细胞外基质保护时，才会更好地提高其生物利用度，取得更好的修复效果。

细胞外基质提供适应的修复微环境

组织修复和再生，与细胞微环境息息相关。简单来说，微环境由两个基本组成部分组成，一个是细胞外基质（ECM），而另一个是细胞分泌的外泌体、生长因子等功能性物质。二者缺一不可，彼此相辅相成、紧密结合。因此，光有外泌体，没有细胞外基质是远远不行的。

其实，除去细胞外基质对外泌体的负载和保护作用，其本身也具备出众的再生和修复能力。除了提供细胞存在的平台，细胞外基质的多元组成既可以为细胞的生理活动提供养分，并驻留在原位，成为机体自身的细胞外基质的一部分；又能够通过其本身的生物学特性来协同外泌体，实现更好的修复和再生效果。在经典的修复再生过程中，细胞外基质可以调节干细胞的表型和表达，而外泌体则含有控制干细胞分化的表型特异性指导因子（miRNA，RNA和蛋白质）。

简而言之，细胞外基质可以从拓扑结构、生物力学、功能靶点等多个维度与外泌体、生物因子共同作用，从而形成适于组织修复的胞外微环境。

首先，细胞外基质所含有的多种蛋白、多糖成分构建出其独特的三维结构和表面拓扑学特征。除支撑组织的生理形态外，还能够调控募集细胞的黏附、增殖和分化行为。近年来，人们更是发现细胞外基质构建的拓扑学结构与免疫细胞的免疫应答等行为息息相关，进而调控组织再生。

再者，细胞外基质本身具有其独特的生物力学性质。不同弹性模量、不同硬度的基质，能够引发细胞的不同表现行为和分化方向，也会引起细胞分泌和募集因子的不同。

细胞外基质极为多元的组成能提供不同的生物学效果，从而建立修复微环境。举例来说，细胞外基质中的纤连蛋白因可与细胞表面的整合素蛋白的α5β1结合，充当修复过程中细胞与细胞外基质交流沟通的重要参与者，并且调控细胞的黏附、增殖、形态和分化等行为；蛋白聚糖通过参与调节细胞外基质的组装和维持，并通过与生长因子的相互作用参与细胞增殖等细胞行为，在组织的生理和生物力学功能中发挥重要作用。正是由于细胞外基质打下的坚实基础，才能让外泌体、细胞因子等活性成分进一步“锦上添花”。

另外，近几年研究中还发现，细胞外基质的结构能结合和锚定多种生长因子（如VEGF，HGF等）、多肽短链。一方面，通过构型调整来更好地发挥其生物活性；另一方面，则能形成生长因子梯度，从而介导修复和再生过程的进行。可以想象，这是唯有细胞外基质才能实现的高度复杂而有序的生物过程。相比之下，仅仅使用外泌体完全无法实现上述空间上的介导过程。这也解释了为何直接使用外泌体或生长因子时，往往修复和再生效果并不如人所愿。

关于细胞外基质和外泌体之间的作用，目前依然还在不断研究中。然而，我们已经可以知道的是：细胞外基质是组织再生的舞台，而外泌体则是舞台上的演员。演员可以让舞台更加熠熠生辉，但舞台却是整个根基所在。二者有机结合，则能带来最好的演出效果。

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细胞外基质/外泌体组合的应用

目前，细胞外基质/外泌体这一组合有了不少应用实例，其作用效果极为明显。

国外的研究中，以细胞外基质中的胶原为支架组成并负载外泌体。这一体系增加了外泌体在体内的保留时间、延长了释放过程，同时也在心脏组织的修复中取得了更好的效果。无独有偶，在另一项研究中，科学家则利用了仿细胞外基质的丝蛋白/壳聚糖复合体系，并通过慢性糖尿病患者皮肤创面愈合模型来考察了作用效果。可以发现，这一仿细胞外基质和外泌体体系具有协同作用，能加速皮肤创面再生。

而国内的部分研究则更进一步，将“全成分”的细胞外基质、玻尿酸、外泌体结合，并考察了其在人体上的作用效果。从临床实验中可以发现，该体系能够显著淡化眼纹，令眼部更显年轻态。随着年龄的增加，部肌肤胶原蛋流失增加，弹性纤维化断裂，基底层上真皮与表皮连接不再那么紧密。于是乎，就产生了各类细纹。而通过细胞外基质、玻尿酸、外泌体这一复合体系，一方面外源性途径引入了胶原、糖胺聚糖等重要基质成分，撑起来了眼周结构；另一方面通过其本身的生物学效应，内源性途径增加细胞外基质分泌。通过双管齐下的方式，迅速起效。

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文末小结

随着技术的进步，外泌体已经越来越被人们熟知，其应用也愈加广泛。外泌体是具有纳米尺寸的细胞囊泡，具有高生物活性，能参与细胞之间的交流，调控炎症水平、促进组织再生。然而，外泌体提取较为困难，本身也不具备结构性的功能，因此单独使用有所局限。

作为细胞外基质中的一部分，当外泌体回到细胞外基质中时，能够发挥出更为强大的作用，更起到“锦上添花”的效果。细胞外基质一方面是外泌体最理想的载体，帮助维持外泌体的活性；另一方面细胞外基质能够构建出最适宜再生的细胞外微环境，从而让外泌体能更加有的放矢。

目前，国内外相关的研究正如火如荼地进行中。相信，不久的将来，细胞外基质/外泌体这样的明星组合会越来越多地出现在我们面前。

参考文献

谁持彩练当空舞：干细胞基础与临床研究进展

— END —

- 科普情怀责任 -

外泌体细胞保存液是做什么的？

细胞保存液起到保持、固定细胞原形态结构的作用，是病理细胞诊断基础，因为如果细胞形态结构发生变化，可能会带来诊断结果的误差，所以需要细胞保存液进行固定细胞形态，细胞保存液也是液基细胞试剂的核心构成。

液基薄层细胞制片检查系统处理技术诞生于1991年美国等国家，率先应用于妇科细胞学检查，国内从2001年开始作液基细胞学筛查宫颈癌的研究，使该项技术得到迅速发展，被称之为一场细胞学制片技术的革命。

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细胞保存液适用于宫颈脱落细胞检查、胸腹水脱落细胞检查、尿沉渣检查、痰液脱落细胞检查、针吸细胞检查，基本上病理科、妇科、内科、外科、泌尿科等科室会用到。液基薄层胞学检测技术特别适用于所有的女性的宫颈癌的早期诊断,是一项非常值得推广应用的临床检验技术。

脱落细胞保存液适用于各类脱落细胞如宫颈粘液、阴道分泌物、痰、鼻咽分泌物及其它粘稠性标本的处理，以佳效果进行细胞形态学检查，可以溶解、去除各类脱落细胞标本中影响显微镜下可见的粘液、杂质，便于病理学及细胞学检查。

液基细胞检测试剂盒主要由细胞保存液、细胞裂解液、提取液、稀释液、消化酶、防腐剂等及必要的细胞承载或制片器具组成，用于临床检验分析前细胞或微生物的保存、运输、提取、分离、沉淀、固定、制片等，用于各类脱落细胞如宫颈粘液、阴道分泌物等标本的处理，以佳效果进行宫颈癌筛查、炎症、HPV滴虫、霉菌等细胞形态学检查。

综上所述，细胞保存液是液基细胞检测试剂盒的成分之一，主要作用是为了保存和稳固细胞。

如何从尿液中快速、大量提取高质量、高纯度的外泌体？

大学实验室一般就是像你说的用各种试剂盒，最好的基本上是进口的，大部分确实比较费时。

我从大学实验室到工作岗位，试剂盒各种各样用过不少，没有能够全面令人满意的，要求质就不能要求量，要求快就不能要求好，很心累。

但是最近试用到一家新的初创公司的试剂盒，基本上可以说是全面手，提取外泌体我操作半个钟头就搞定，得到的外泌体质量也很上乘，各种下一步研究操作都很顺畅。

一开始我以为是国产的，十分振奋，后来了解到好像技术也还是国外引进的，或者说战略合作的关系吧，总之是相当好用。

你有兴趣可以去联系试试，深圳的一家公司，叫做“华启生物科技”，试剂盒名字应该是叫做ExoHQ，反正是提外泌体的试剂盒。

谢谢，全手写，望采纳！

New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles

原文链接： Huilin Shao, Hyungsoon Im, Cesar M. Castro, Xandra Breakefield, Ralph Weissleder and Hakho Lee. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles. Chem Rev. 2018 Feb 28;118(4):1917-1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534.

该综述发表在Chemical Reviews杂志上，影响因子高达54.301分，对细胞外囊泡的研究方法总结非常全面，基本上目前EVs研究中用到的研究方法，这篇综述都有介绍，十分详尽！通讯作者是哈佛大学的Hakho Lee教授。

Extracellular Vesicles (EVs) 细胞外囊泡是由细胞主动释放的多样的纳米级膜囊泡。类似大小的囊泡可根据其生物发生、大小和生物物理性质进一步分类(如外泌体、微囊泡)。虽然EVs最初被认为是细胞碎片，因此未被重视，但现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信和疾病诊断和预后的循环生物标志物的重要载体。

该综述的内容包含：

生物流体（Biofluids）中含有大量的EVs，这些EVs可以从Parental Cells转移不同的分子去其他细胞，包括：蛋白，mRNA/miRNA，DNA等。

EV的形成决定了其膜组成。

微小囊泡的膜组成最能反映其Parental Cells(母细胞)的质膜。

相反，外泌体中已经鉴定出特异性的内体蛋白分子，这反映出外泌体形成的机制。内体分选复合物（ESCRT）已被广泛认为用于调节和引导特定分子进入MVB的腔内囊泡。ESCRT及其四个主要复合物（ESCRT 0，I，II和III）负责传递泛素化蛋白，用于溶酶体降解和蛋白回收。最近的研究表明，特定的ESCRT家族蛋白的耗竭可以改变外泌体的蛋白质含量和细胞释放外泌体的速率。更有趣的是，发现外泌体富含ESCRT系统的成分（例如TSG101和Alix），可用作外泌体识别的标记。

ESCRT不是介导外泌体形成的唯一机制。其他不依赖ESCRT的过程似乎也能以相互交织的方式参与其形成和分泌。外泌体也富含ESCRT非依赖性的分子。例如，四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81已被证明参与内体小泡运输。小GTP酶的Rab家族参与小泡运输和与质膜融合表明这些蛋白在释放外泌体中的作用。另外，外泌体中神经酰胺水平升高，抑制鞘磷脂会引起的外泌体释放减少，表明鞘磷脂酶与囊泡释放有关。

外泌体和微囊泡都包含核酸，包括miRNA，mRNA，DNA和其他非编码RNA。自从最初发现EV含有RNA，人们一直非常关注EV RNA用作诊断生物标志物。在开创性的工作中，Skog等人发现胶质母细胞瘤患者的血清外泌体含有特征性的突变mRNA（EGFRvIII mRNA）和miRNA，可用于提供诊断信息。这些核酸的发现导致了这样的假设，即EVs可以在细胞之间转移遗传信息。确实，瓦拉迪等人和Skog等表明，EV含有转移进入宿主细胞后仍然可以翻译的mRNA。EV中也有逆转座子和其他非编码RNA的表达。逆转录转座子序列和miRNA以及可翻译的mRNA都通过EV进行转移，这些成果突出了EVs作为遗传信息的载体和传播者的重要性。

虽然传统的光学显微镜的衍射极限接近EV的大小，但是不能产生清晰的图像。高分辨率EV图像需要通过电子显微镜(EM)或原子力显微镜(AFM)得到。然而，这些方法的通量有限，因为需要专门的染色方案和设备。

（a）扫描电子显微镜（SEM）提供三维的表面拓扑信息。

（b）透射电子显微镜（TEM）具有出色的图像分辨率，可结合免疫金标记一起使用来提供分子表征。

（c）冷冻电镜（cryo-EM）无需大量处理即可分析EV形态。

动态光散射 (DLS)，也称作光子相关光谱或准弹性光散射，是一种物理表征手段，用来测量溶液或悬浮液中的粒径分布，也可以用来测量如高分子浓溶液等复杂流体的行为。当光射到远小于其波长的小颗粒上时，光会向各方向散射（瑞利散射）。如果光源是激光，在某一方向上，我们可以观察到散射光的强度随时间而波动，这是因为溶液中的微小颗粒在做布朗运动，且每个发生散射的颗粒之间的距离一直随时间变化。来自不同颗粒的散射光因相位不同产生建设性或破坏性干涉。所得到的强度随时间波动的曲线带有引起散射的颗粒随时间移动的资讯。动态光散射实验易受灰尘或杂质影响，故样品的过滤和离心十分重要。

动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。

动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。

在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但是动态光散射技术由于是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。

纳米粒子跟踪分析(NTA) 是一种光学粒子跟踪方法，用于确定粒子的浓度和大小分布。用光束照射样品中的粒子。当粒子散射光并经历布朗运动时，摄像机记录下每个粒子的路径以确定平均速度和扩散率。与DLS的体散射测量不同，NTA跟踪单个粒子的散射。

然后，此信息将用于数学计算浓度（即视野中的粒子数量）和尺寸分布（即通过Strokes-Einstein方程的流体动力学直径，图5b）。为了准确定量异质囊泡的浓度和大小，NTA程序需要精确优化摄像头和分析设置。可能需要使用不同设置进行单独测量，以获取异质混合物中EV子集的准确读数。

EVs在大小、起源和分子组成上都是异质性的；除此之外，它们还存在于不同的复杂的生物流体中，包括血、胸腔积液、腹水、乳汁、唾液、脑脊液和尿液。这些流体中还含有大量的非囊泡大分子结构，可能会干扰EV的分析。所以EV的分离和富集显得尤为重要。

超速离心法（80%）和密度梯度离心法（20%）是最常见的两种高通量混合分离法。根据它们分离机制，这些方法可以分为三大类:密度、亲和和大小。

用不同的离心力将颗粒分离:以较低的离心力(300g)去除细胞碎片，而以较高的离心力(100000g)对EV进行沉淀和浓缩。尽管该方法是应用最广泛的金标准，但它也有许多缺点，如体积大、仪器昂贵、处理时间长、过程繁琐、被聚集的蛋白质和核蛋白颗粒污染以及需要大量的样品。

蔗糖梯度离心法是一种更为严格的超速离心法，它有助于进一步分离不同密度的囊泡，通常用于分离外泌体(悬浮密度为1.15至1.19 g/mL)。在这种方法中，一个包含不同大小囊泡和大分子的样品在一个密度从上到下递增的梯度表面上被分层。在离心过程中，不同的分子以不同的速率通过梯度沉积。由于其分辨率更高，该方法被认为可以分离更高纯度的EVs(特别是外泌体)；然而，它面临着许多与超速离心法相关的限制。更加新的等渗梯度(如碘黄醇梯度)法被认为效果更好。

最近，基于聚合物共沉淀法的商业试剂盒(例如，ExoQuick, Exo-Spin)已被开发用于EV富集。这些试剂采用降低EV的水合作用(从而降低溶解度)导致沉淀，然后在低离心力的情况下，沉淀的EV产物可以很容易地、重复性地分离出来，从而避免了长时间的超速离心法操作。然而，这些试剂盒对于大规模使用来说是昂贵的，而且对于EV来说缺乏特异性。该方法还容易产生非均相聚合物颗粒。由于这些试剂均降低了EV和蛋白质的溶解度，因此该方法还可共沉淀脂蛋白和Ago-2 RNA复合物。因此，共沉淀法作为EV分离方法受到了限制。

大小排阻色谱法根据它们的分子大小通过凝胶过滤来分离囊泡和其他分子。这种凝胶由含有特定大小分布孔隙的球形珠组成。当样品进入凝胶时，小分子扩散到孔隙中，而大分子则直接洗脱。因此，大分子比小分子更早地离开色谱柱，这使得分子的停留时间与色谱柱的大小相关联成为可能。近年来，该分离方法已被应用于从复杂的生物媒介中分离纯化囊泡。Sepharose, GE Healthcare; qEV, iZon等商业公司也正在开发商业的产品以简化EV富集，这些产品的排除柱都大约是75纳米孔径的树脂。蛋白质和其他较小的污染分子被滞留在孔径中，而较大的囊泡(75 nm)可以迅速通过并在空隙中被洗脱。大小排阻法可将EV与可溶性蛋白分离；为提高分离的效率和分辨率，需要考虑多种因素，包括介质类型、孔径、EV与介质之间的相互作用、柱的尺寸、柱的填充以及流速等。

为了提高复杂生物流体的EV分离效率和特异性，人们开发了多种新的EV富集方法。然而，与传统方法相比，这些新方法中的大多数具有较低的吞吐率，应加以解决使之变得实用。

基于分子大小的分离是一种很有潜力的方法，可以将EV与大型细胞碎片分离开来。各种微流体过滤系统已经被开发出来，用于从大的细胞碎片和蛋白质聚集物中分离EV，这些系统大部分是基于分子大小差异。例如,Rho等人构建了一种微流控设备，该设备使用膜过滤器对未处理的血液样本进行筛选，来分离EV。膜过滤器的大小∼1μm。在膜的下方插入一个毛细管，用于引导过滤后的EV进入收集通道。膜过滤器和毛细管导向器夹在两个环形磁铁之间；这种设置在进行大量的样品处理时可以方便地更换过滤器集。

Lee等人最近使用声波以无接触方式对EV进行细分。这种分离利用超声波驻波，根据囊泡的大小和密度对其施加不同的声交互作用力。该装置由一对相互交错的换能器(IDT)电极组成，用以产生跨流动通道的驻波表面声波。

EV蛋白主要来源于胞质膜、胞质醇，而非其他胞内细胞器(如高尔基体、内质网、细胞核等)。EV蛋白质的构成提示了囊泡的生物发生和cargo sorting(这个翻译有点怪)。因此国际细胞外囊泡组织建议应该仔细鉴定EV蛋白，特别是跨膜蛋白和胞质蛋白。

在哺乳动物中，跨膜蛋白和脂质结合的细胞外蛋白(如内贴蛋白)都与微囊泡和外泌体有关。外泌体的跨膜蛋白富含四聚体蛋白(如CD9、CD63和CD81)一个具有四个跨膜结构域的蛋白质超家族。四聚体蛋白参与细胞膜的转运和生物合成的成熟，在外泌体中高表达，这一特性使得四聚体蛋白被用于外泌体的定量和表征。然而，需要注意的是，四聚体蛋白并不只在外泌体中唯一表达。另一方面，微囊泡富含整合素、选择素和CD40配体，表明它们来自于细胞的质膜，EV富含特异的跨膜蛋白受体(如表皮生长因子受体/ EGFRs)和黏附蛋白(如上皮细胞黏附分子/EpCAM)。由于许多跨膜蛋白参与了正常生理和疾病的发病机制，它们被用作重要的病理生理学EV生物标志物。

EV相关的囊内蛋白具有多种功能。它们包括具有膜或受体结合能力的参与囊泡运输的胞质蛋白，如TSG101、ALIX、annexin和Rabs。EV还富含细胞骨架蛋白(如:内酯、肌凝蛋白和小管蛋白)、分子伴侣蛋白(如:热休克蛋白/HSPs)、代谢酶(如:烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶/GAPDH和核糖体蛋白)。有趣的是，最近的研究发现EV蛋白可以被受体细胞有效地运输和接收，从而在体内和体外引起强烈的细胞反应。这带来了EV作为治疗和药物载体的新机遇。

EV蛋白的定量和特征鉴定不仅对阐明EV的生物发生和cargo sorting有重要意义，而且对鉴别生理和病理标志物也有重要意义。然而，传统的蛋白质分析，包括Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)，通常需要大样本量、大量处理和/或庞大的专门仪器，因而不太适合临床应用。

在EV蛋白评估时，Western blotting可能是最常用的技术，用于提示与EV相关的靶蛋白的存在。在这个过程中，纯化的囊泡制剂(通常通过现行的梯度超离心法金标准制备)可以用含有变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲裂解液进行处理。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS−PAGE)分离蛋白裂解物，然后转移到膜上，对特定的蛋白target进行免疫印迹。虽然这种方法有很长的准备和处理时间( 10h)，但是Western blotting可以提供关于蛋白质分子大小的有用信息。

不像Western blotting，ELISA只能在相对较小的范围内对目标蛋白进行定量，质谱分析可实现高通量肽谱分析。纯化的EV制剂经过酶消化和肽分离，然后用质谱仪电离分析。在这个复杂的过程中，多个步骤严重影响EV蛋白组学分析。除了有效的EV纯化，质谱分析之前的肽分馏被认为是鉴定囊泡蛋白的一个重要前提。通常通过三种主要方法实现：(1)SDS−PAGE，(2)二维液相色谱和(3)基于等电聚焦的分馏。

值得注意的是，既然质谱分析可以鉴定消化后的肽片段，那么适当的蛋白质鉴定、定量和验证是必要的。已经有两种用于定量的技术方法：基于标签的和无标签的。在基于标签的定量分析中，标签(等压或同位素)被用于比较分析。无标签的定量分析中，色谱强度的谱计数被应用。识别出的候选蛋白可以使用其他传统的蛋白质技术如Western blotting进行验证。在检测灵敏度方面，质谱法通常不如基于抗体的技术敏感。

虽然质谱分析需要大量的准备和处理时间(数天)，但它可以提供高通量、定量和EV比较蛋白质组分析。到目前为止，已有成千上万的囊泡蛋白被系统分类，蛋白质-蛋白质相互作用分析。基于质谱的哺乳动物和细菌EV的蛋白质组学分析的详细讨论已经在一些综述中被强调。这些网络和相互作用的研究有助于阐明EV载体的功能活动及其在细胞间远距离通信中的重要作用。

为了解决EV蛋白质定量相关的技术挑战，新一代生物传感器正在开发中。与传统的蛋白质检测方法相比，这些生物传感器利用独特的传感机制，可以检测各种大小和分子含量的EV。这些技术中的许多只需要更小的样本量和更少的样本处理过程，因此非常适合于医疗应用。

流式细胞术是一种基于光散射和荧光激活来分选单个大颗粒(如细胞或微米大小的实体)的强大的技术，然而，传统的流式细胞术对检测直径小于500 nm的小颗粒的灵敏度和分辨率有限。此外，它还受到高光学背景的影响，由于鞘层流体中存在小颗粒(约200 nm)。用传统流式细胞术量化EV时，大量的小EV可能被忽略或者计数偏低：可能同时有多个小的囊泡被照亮被计数成一个单独的事件，这种现象被称为“群体理论”。

为了解决传统流式细胞术的弊端，微米大小的乳胶珠被用来绑定多个囊泡。然后用荧光抗体对结合的EV进行染色，并对其蛋白标记物进行鉴定。然而，这种方法缺乏分析单个囊泡的能力，并且不能区分不同的囊泡亚群，这可能会导致特征的丢失。

该技术主要基于磁性纳米粒子(MNPs)。由于大多数生物物质天然缺乏铁磁背景，这种传感几乎不受同系统中其他生物样品的干扰。因此，即使光学上浑浊的样品对磁场也是透明的；当靶分子被特定的MNPs靶向时，它们与自然的生物背景形成了强烈的对比。在基于核磁共振(NMR)的磁检测中，MNPs置于NMR磁场中，产生局部磁场，改变周围水分子的横向弛豫率，放大分析信号。因此，核磁共振减少了样本处理过程，提高了检测灵敏度，已经被开发用于多个医疗点应用(例如，直接从血液样本中检测循环肿瘤细胞和细菌)。

但是将这种技术运用在EV检测上却遇到了挑战，因为EV明显比肿瘤细胞小1到2个数量级。Shao等人开发了一种专门用于EV检测和蛋白质分析的新分析技术。此方法采用两步生物正交点击化学方法来标记EV，这种小分子(200 Da)标记策略并没有显著增加抗体或MNP的大小，从而提高了从非结合抗体和MNPs中保留目标囊泡的效率。使用微流控芯片上微核磁共振(μNMR)直接测量EV来确定EV生物标志物的丰度。

相比传统的蛋白技术，μNMR系统表现出更好的检测灵敏度：比WB和ELASA灵敏10 3 倍。Shao等人利用这种集成技术可研究在培养皿中生长的多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系中的EV。比较蛋白分析证实，EV确实反映了其亲代细胞的蛋白概况，组合GBM的四种标志物(EGFR、EGFRvIII、PDPN和IDH1)

R132H)可用于区分癌症来源的EVs与宿主细胞来源的EVs。

鉴于EV的尺寸小，一种新的快速无标签EVs检测方案：表面等离子体共振(SPR)被提出。SPR是指在入射光照射下，金属介电界面上传导电子的集体振荡。不同于其他基于时敏荧光和化学发光探针的光学检测方法，SPR传感检测金属-介电介面附近生物分子结合相关的局部折射率变化，应用于无标签和实时检测。

RNA是EV携带的主要核酸。与细胞中的RNA相比，eEV运输的RNA通常更短(通常200个核苷酸，但也有长达5 kb的)。它们主要是非编码rna，包括microRNA(miRNA)、tRNA (tRNA)、长链非编码RNA (lnRNA)和片段化的mRNA。编码mRNA (mRNA)已在长度为200~1000个核苷酸的转录组中被识别。mRNA可以翻译成蛋白质，而miRNA可以调节受体细胞中靶mRNA的翻译。EV中RNA的数量和性质可以根据其来源的细胞类型而变化。

由于它们在受体细胞中保留了功能，研究人员提出了有趣的假设，即可能存在专门的机制将不同的RNA分配给EV运输到特定的受体细胞，或可能利用这些机制运送治疗性RNA到特定的部位。这是一个活跃的研究领域，已经有一些综述对其进行阐述。

近年来的研究发现，EV中含有相当比例的母细胞的mRNA，其中许多是细胞特异性的mRNA。这些mRNA分子通常以片段的形式存在于EV中，保护其不被RNA酶降解，使它们成为强有力的循环生物标志物。

此外，已在多个研究中得到证实：EV中一些2 kb的mRNA分子能够编码支持蛋白质合成的多肽(即，蛋白质翻译的功能)。这些研究强调了EV作为特定的细胞信使在影响受体细胞和促进细胞间通讯等多方面的作用。

miRNA是一类小的非编码rna(一般为17 - 24个核苷酸)，通常通过靶向mRNA的3’非翻译区介导转录后基因沉默。通过抑制蛋白质的翻译，EV miRNAs在许多生物过程中都是强有力的调控因子。不同于EV中的循环mRNA，miRNA可以以多种稳定形式存在于体液中。除了被包裹在EV中，循环miRNA还可以被加载到高密度脂蛋白或结合到囊泡外的AGO2蛋白上。目前的证据表明，虽然大多数循环miRNA都与RNA结合蛋白相结合，但在EV中也能发现少量的miRNA。然而，miRNAs在EV中的分布仍不清楚。与mRNA的情况一样，EVs中的miRNA表达反映了其细胞来源，但与亲代细胞略有不同。一些miRNA已被发现优先表达在EV中，并在受体细胞中保持功能以调节蛋白翻译。最近的研究还发现，在哺乳动物细胞培养中常用的胎牛血清可能在体外EV制备过程中导致miRNA伪影。

通过NGS，我们还发现有其他类型的RNA存在EV中。这些RNA包括tRNA，rRNA，小核RNA(snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)以及长链非编码RNA (lncRNA)。参见上表。

最近的研究表明某些EV可能含有DNA片段。这些DNA是双链片段，范围从100个碱基对(bp)到2.5 k bp，EV外部还有一些与之相关的2.5k bp的DNA片段。这些片段代表整个基因组DNA，可用于鉴定亲代肿瘤细胞中存在的突变。虽然有可信的证据表明在EV中存在DNA，但其功能尚未确定。

EV核酸作为一种潜在的循环生物标志物和受体细胞间的调节因子已被广泛研究。传统的核酸提取和分析工具已经成功地为我们理解EV核酸奠定了重要的基础。由于EVs中核酸的含量较低，开发高效的提取方法和灵敏的检测策略是非常重要的，特别是在小样本中对稀有目标分子进行检测。

随着人们对利用EV核酸作为微创诊断标记的兴趣日益浓厚，新的生物传感器技术已被开发出来，使提取和分析变得更加高效、快速。这些新平台中有许多提供了对目标核酸标记的敏感定量，并且能够在复杂的生物学背景下识别疾病标记，甚至包括单核苷酸点突变。这为个性化临床医疗开辟了许多新的机会。

虽然传统PCR是检测基因/转录突变的强大技术(例如，EGFRvIII缺失突变)，但其敏感性有限，其在检测单核苷酸突变方面存在很多不足。这个问题与EVs特别相关，因为在野生型转录本的大背景中，突变转录本的比例很低。Chen等人最近采用了一种液滴数字PCR (ddPCR)技术来检测EV中的罕见突变。

Shao等人最近开发了一种综合微流控平台，用于现场EV核酸分析，该平台集成了三个功能模块：靶向富集EVs，芯片上RNA分离，实时RNA分析。这个平台被称为免疫磁性外泌体RNA(iMER)分析平台：利用抗体功能化的磁珠从宿主来源的囊泡中分离癌症特异性EVs，然后在芯片上裂解免疫磁珠吸附的囊泡。当EV裂解液通过玻璃珠过滤器时，选择性吸附EV RNA并从过滤器中洗脱，用于反转录和qPCR分析。为了简化分析过程，所有关键部件都集成到一个芯片盒中。

随着该系统的发展，作者研究了核蛋白的两个mRNA靶标，MGMT(6-甲基鸟嘌呤)

肿瘤是一种复杂的结构，包括恶性细胞和周围的基质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。最近的研究表明，EVs在肿瘤微环境中促进细胞间通讯，从而调节疾病的发生、发展，并且在治疗反应方面发挥重要作用。

这一大块儿的其他内容大家感兴趣的话可以阅读原文献。

在大多数神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆)中存在类似的疾病进展模型，其中错误折叠的蛋白质自结合形成有序的聚合体并在细胞中聚集。阿尔茨海默病(AD)中，淀粉样蛋白的Abeta肽的形成可能是这些蛋白聚合体中最著名的。帕金森疾病(PD)中，另一种类型的聚合体在细胞内形成，主要由alpha-synuclein(突触核蛋白)组成，称为路易小体。最近的研究表明，许多神经退行性疾病中涉及的错误折叠蛋白出现在EV中。因此，这些囊泡为检测和监测神经退行性疾病带来了新的希望。

AD是一种迟发性神经系统疾病：由于神经变性而导致记忆和认知能力的逐渐丧失。虽然AD的确切病因仍是一个有争议的话题，但很明显，与Aβ肽相关的斑块沉积和与tau蛋白相关的神经纤维缠结对疾病的进展是非常重要的。这些淀粉样肽来源于淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解过程。这一