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免疫细胞化学技术要求（免疫细胞化学技术要求高吗）

2023-01-11 03:55:30 作者：max

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本文目录一览：

1、免疫细胞化学技术的标本的制备
2、免疫组织化学的应用的基本原则
3、求免疫细胞化学技术的细胞生物学定义（百度要删此问题死全家）

免疫细胞化学技术的标本的制备

· 标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件

· 免疫组化对组织和细胞标本的要求

– 保持所检标本原有的结构、形态；

– 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。

· 免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。

– 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。

免疫组化中常用的组织和细胞标本

· 组织标本

– 石蜡切片

– 冰冻切片

· 细胞标本

– 组织印片

– 细胞培养片(细胞爬片)

– 细胞涂片 · 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法

– 最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；

– 石蜡块还能长期存档，供回顾研究。

· 石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。

1、取材的特殊要求及注意事项

· 标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。

· 取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。

– 细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。

1、取材的特殊要求及注意事项(续)

· 避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；

– 镊取组织动作要轻；

– 经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。

2、固定及常用的固定液

· 取材后的组织需立刻投于固定剂中

– 固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；

– 对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

· 常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。

– 醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）

– 醇类（常用乙醇）

– 其它（丙酮）

(1) 醛类

· 甲醛(福尔马林)应用最广

– 原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。

– 优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。

– 缺点：

· 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；

· 醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；

· 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。

– 注意事项：

· 缩短固定时间，降低固定温度(4C)，为此组织块不宜过厚。

· 改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液，减少固定液pH的变化。

· 固定后充分水洗以减少分子间交联。

· 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

· 戊二醛：

– 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

· 多聚甲醛(常用4%)：

– 可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。

· 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。

(2) 醇类

· 最常用的醇类固定剂是乙醇。

– 其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。

– 优点：穿透性强、抗原性保存好。

– 缺点：

· 脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。

· 乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

(3) 其它固定剂

· 丙酮：

– 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。

3、抗原修复——原因

· 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：

– 抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；

– 蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

· 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

3、抗原修复——方法

· 化学方法

· 加热方法

– 水浴加热法

– 微波照射法

– 高压加热法

– 酸水解法

(1) 化学方法

· 主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。

– 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%～0.1%，消化时间为37C，10～40min，主要用于细胞内抗原的显示；

– 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%～0.4%，消化时间为37C、30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示。

· 例如：Laminin、CollagenIV

(2) 水浴加热法

· 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10～15分钟。

– 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，

– 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。

(3) 微波照射法

· 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，持续l0～15分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。

· 此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。

(4) 高压加热法暴露抗原

· 将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压2～3min，可取得极好的效果。

· 由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。

(1) 酸水解法

· 酸水解可使交联断裂、暴露抗原。

· 将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。

· 此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。

加热法的注意事项

· 达到规定的温度(92～95C以上)；

· 维持一定的时间；

· 避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)；

· 加热后必须经过室温自然冷却20～30分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；

· 修复液：

– 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；

– 最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。

4、载玻片的处理

· 抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。

– 新载玻片上有油污，要用洗液浸泡12～24h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。

· 常用的粘附剂有：

– APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）

– Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）

– 铬明胶溶液

APES(3-aminopropyltriethoxysilane)

3-氨丙基三乙氧基硅烷

· 现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);

· 将洗净的玻片浸于此液中20～30秒钟；

· 取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60C烤箱烤干。

Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)

· 将清洁玻片浸于100g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37C放置30min，然后60C烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。

铬明胶溶液

· 试剂：铬明矾(chrome alum) 0.25g

明胶(gelatine) 2.5g

蒸馏水 500ml

· 先将铬明矾溶解于40C少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70 C水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。

· 用时稍加溶化，切片浸入2～3min，过夜晾干。 · 冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。

· 在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。

– 缩短了制片时间

– 抗原性不受损失

· 对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。

· 组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。

1、冰冻组织块的常用方法

· 液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196C)中10～20sec；

· 干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；

– 上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。

– 制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70 C冰箱。

2、切片

· 供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。

· 载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；

· 切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 C 。切片厚度一般为4～8m。

3、切片后处理

· 切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，入4C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。

· 冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。 · 贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20C固定10～20min)，再进行免疫染色。

– 盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。

– 为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。 · 大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：

– 血液、尿液、脑脊液；

– 体腔积液；

– 组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织

– 悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。 · 细胞涂片的方法：

– 手涂法

· 将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。

· 图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。

– 涂片机涂片法

· 将细胞样品制成2×105～6/ml 细胞悬液，吸取50～100l (1～2×104～5cells) 加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。

免疫细胞化学技术要求（免疫细胞化学技术要求高吗）

免疫组织化学的应用的基本原则

免疫组织化学染色在生物医学研究中具有十分广泛的作用。并且涉及许多研究领域。但是，免疫组织化学技术也有其局限性，例如，组织细胞内的待测物质要有抗原性，而且需要有一定浓度方可检出；检出的免疫反应阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白，因此，在实验设计中应充分考虑这些特点。如果实验需要证明已知蛋白为何种细胞合成，需采用分子原位杂交技术解决。为引导初学者在实验设计中合理巧妙地运用免疫组织化学技术，将其应用的基本原则简述如下：

1．确定细胞类型和形态。组织细胞内有些蛋白具有组织特异性，如胶质原纤维酸性蛋白（gial fibrillary acidic protein，GFAP）只存在于星形胶质细胞内．神经丝蛋白（Neurofilament，NF）只存在于神经细胞内。通常把这些具有组织特异性的蛋白称为标记性蛋白（Proteiniliaker）。通过标记性蛋白的特异性抗体可确定细胞种类。有些细胞（如表皮内朗格汉斯细胞和黑色素细胞等）在光镜下不易辨认，通过对胞质内的特定蛋白实施免疫组化染色，便能清楚显示此类细胞外形轮廓。这种作用在神经科学研究和肿瘤临床病理中显得尤为重要。

2．辨认细胞产物的来源。利用某些细胞产物为抗原，制备相应的抗体，对组织细胞实施免疫组织化学染色，以确定细胞产物的来源。如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化染色技术辨认，据此可研究细胞的分泌功能及对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等，了解细胞分化程度。

3．确定细胞的分化程度分化程度。不同的同一类细胞多表达不同的标志性蛋白，根据对这些不同蛋白的鉴定可确定细胞的分化程度。例如，神经上皮细胞的标志性蛋白是巢蛋白（nestin），当其分化为放射状胶质细胞时表达波形蛋白（vimentin）。在神经元发生期分化为成神经细胞时则表达Ⅲβ神经微管蛋白（TUJl），成神经细胞分化为成熟的神经元时表达神经丝蛋白（neurofilament，NF）。

4．追踪神经纤维束和它的投射区。用于此目的的免疫组织化学方法常与轴浆运输示踪法相结合来研究神经元之间的联系。轴浆运输示踪法是利用某些物质可被神经末梢摄取。经轴质逆行运输到胞体的特点．用组织化学方法显示出神经元的轮廓。常用示踪剂有辣根过氧化物酶和荧光金等。例如。为观察周围神经系统或中枢神经系统某核团神经纤维投射．先将示踪剂注射到动物神经纤维末梢部位，使动物存活一段时间，在预期神经纤维投射部位取材，先通过组织化学方法使示踪剂定位，再实施免疫组织化学方法确定其性质。

5．在临床病理中的应用。如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后。辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。