细胞冻存有什么注意事项（细胞冻存有什么注意事项和要求）

本文目录一览：

• 1、求细胞冷冻保存方法和注意事项
• 2、细胞冻存前后需要考虑哪些环节
• 3、细胞的冷冻和储存
• 4、细胞的冻存与复苏要注意什么 – 手机爱问
• 5、细胞冻存的7个注意事项

求细胞冷冻保存方法和注意事项

博凌科为生物科技-为你解答：1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 90 ％致密度。2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4℃ 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。4、冷冻保存之细胞浓度：（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。6、冷冻方法：（1）传统方法: 4℃ 10 分钟--- -20℃ 30 分钟--- -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜)--- 液氮槽vapor phase 长期储存。（2）程序降温：利用等速降温机以1 ～ -3℃/分钟之速度由室温降至120℃，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。7、材料：（1）生长良好之培养细胞（2）新鲜培养基（3）DMSO (Sigma D-2650)（4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)（5）0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)（6）血球计数盘与盖玻片（7）等速降温机(KRYO 10 Series II)8、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。（5）冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃ 10 分钟 -20℃ 30 分钟 -80℃ 16～18 小时(或隔夜) 液氮槽vapor phase 长期储存。（6）冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL

细胞冻存前后需要考虑哪些环节

（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。细胞冻存前应保证细胞的活力好，无污染

（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

（3）3.一定要保证DMSO的浓度是10%，冻细胞要舍得用进口的DMSO

（4）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

（5）慢冻,快解冻。细胞在 -15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤，缓慢降温有助于减少损伤，故放入 -20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便，保存时间过久会影响细胞活力。

细胞的冷冻和储存

细胞生长时的表型会发生改变或漂变，所以细胞必须计数，计数后应马上冻存。

冷冻细胞前

1 检查冷冻细胞所需试剂和器具是否备齐。

2 确认有无菌的可用于冷冻的冻存管 。

3 确认液氮罐里是否有冻存细胞的位置。

冷冻细胞

1 将培养基中的细胞培养至对数生长期。

2 进行活细胞计数，不要冻存死细胞比例高达20％以上的细胞。

3 决定冻存量，安排需要几个冻存管。

冻存细胞在融化时要稀释10 倍，而稀释后的液体是5X种子液。

例如：如果种子液的密度为5.0 X 105 个／ ml, 那么融化后重新悬浮细胞时细胞的密度为2. 5 X 106 个／ ml, 所以冻存细胞时的细胞密度为2.5 X 107 个／ ml 。

1 准备好冷冻培养基， 分装成1 ml, 冻存培养基通常包括一般培养基、10%~20%血清、5%~10％的甘油或二甲基亚砜。如果你不清楚用什么，那么就使用20％的血清和10％的二甲基亚砜。

2 在冷冻培养基中用移液管小心吹打粒状沉淀。

3 每个冻存管中分装1 ml 冻存培养基，放置在冰上操作。

4 把冻存管放入冻存盒中，做好标记，放入-60C 或更低温度的冰箱，放置16~24 小时。

5 倒些液氮至冰盒内，把细胞从冰箱转移到液氮罐之间要把细胞放在这样的冰盒内。如果没有现成的液氮，可以把细胞放在干冰上。

6 将细胞放置在合适的位置，立即做好记录。

液氮的使用

1 细胞常常保存在液氮罐或是液氮制冷柜中，但是要每隔几个星期补充液氮

2 自动填充液氮的罐子，必须定期检查，以保证管道的畅通以及液氮罐没有空掉。

3 在操作液氮罐内容器时要戴好厚手套，否则会冻伤手臂。

4 从液氮罐内拿出细胞时至少也应戴上乳胶手套

5 不要在液氮罐内悬吊物品，也不要吸入气化后的液氮，用手挥开液氮后，就能看见液面了。

6 戴好保护眼睛的眼罩，以免操作冻存管时，冻存管爆炸溅伤眼睛。

7 决不能把没有拧紧的管子放入液氮中，而且要提前找负责液氮罐管理的人员确定位置，不要乱放。

8 不要关闭警报，定期检查。

9 如果听到了液氮罐的报警声，立即通知实验室管理人员。如果是周末或凌晨，则先检查确认是否是由于液氮面过低或温度过高引起的报警，再联系负责液氮罐的人员。

细胞的冻存与复苏要注意什么 – 手机爱问

细胞冻存与复苏步骤注意事项

一、原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏

1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2. 培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。

3. 二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。

4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

7. 记录复苏日期。

【注意事项】

1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。

5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

细胞冻存的7个注意事项

一、细胞冻存

方法：

冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7） 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理，

对于贴壁细胞：

1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次

2胰酶消化

3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止

4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）

5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存

悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤

注意事项：

错误的时机：

细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已 经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。

解决：

最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。

2.细胞太少：

冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。

解决：

离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。

3.盖子不紧：

冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。

解决：

选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。

4.单薄的冻存盒：

放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。

解决：

选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）

5.-80度太久：

放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）

解决：

尽快转入液氮。

6.液氮不足：

液面不能漫过所有细胞

解决：

定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

7.取错细胞：

找不到/拿错冻存管。

解决：

每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。

二、细胞复苏：

方法：

从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

离心， 1000rpm，5min；

弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

次日更换一次培养液，继续培养。

注意事项：

取错细胞：

拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）

解决：

（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。

（2）拿细胞时戴手套！

2.水浴时间太长：

2min还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）

解决：

（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。

（2）要是冬天，就选用保温盒。

3.冰盒内时间太长：

复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）

解决： 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

4.失去耐心：

复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）

解决： 不要换液，耐心等待，两周后再做决定。