elisa外泌体内（elisa 内参）

本文目录一览：

• 1、什么是外泌体？
• 2、New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles
• 3、早期胃癌和癌前病变的诊断新方法，与旧方法比有哪些优势？
• 4、外泌体提取策略
• 5、特发性婴儿动脉钙化的基因治疗模拟
• 6、什么是外泌体_外泌体是什么？

什么是外泌体？

什么是外泌体

人到中年，最难以启齿的矛盾便是脸上越来越多的皱纹和内心与日俱增的

“抗老需求”之间的矛盾。为了今天的容颜不被明天改变，什么玻尿酸、水光针甚至是干细胞美容，我都勇于“尝鲜”。而作为美容界的后起之秀——“外泌体”，我更是不愿错过。毕竟它虽然是近两年兴起的美容模式，但其发展历史也已经有40多年了，而它的美容功效更是有口皆碑，比干细胞美容有过之而无不及，一时间，关于外泌体美容的宣传铺天盖地，可谓是风头无两，颇有“江湖大佬”的地位。但也正因为如此，我们更要科学严谨的对待外泌体美容，了解它的原理，才能更好的应用它。

外泌体，从字面上看，就是细胞向外分泌的物体。科学释义是：细胞所分泌的直径为30~150nm的双层磷脂囊泡，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。

外泌体的作用机理

外泌体最大的功能便是人体的“通信兵”，它能在细胞间传递物质，从而调控受体细胞的功能及生物学行为。通俗的说，外泌体就好像一辆“细胞货拉拉”，装了自家一堆有用的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，进行“卸货搬家”。

希吉亚外泌体分离方法

外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，希吉亚外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、免疫磁珠法等。

Ø

超速离心法：超速离心法是大家最熟悉的一种分离方法，文献中应用最多且也是目前比较受到认可的方法。超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法耗时耗力，往往需要8-30个小时；且需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。

希吉亚外泌体美容机制

Ø

免疫磁珠法：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。

促进细胞再生。外泌体可以有效刺激受体细胞，释放细胞活力，促进其再生和新生。因而可以帮助淡化祛除斑点，促使肌肤光亮细腻。

修复受损细胞。外泌体外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成，从而让帮助修复受损的肌肤屏障。而且它可以提高受损部位的修复能力和愈合能力。

抑制炎症产生。外泌体可以诱导巨噬细胞向M2型极化，从而降低了巨噬细胞诱发炎症反应的能力，从而抑制炎症。我们肌肤的很多问题都与肌底炎症有关，而外泌体可以通过抑制炎症来让肌肤从内而外的健康起来。

干细胞疗法围绕使用完整细胞来替代丢失的组织。相反，外泌体是与细胞分离的囊泡。外泌体促进恢复青春活力的方式是利用外泌体中携带的有效成分来帮助其他细胞。

干细胞和外泌体的另一个主要区别是前者仅从身体的特定部位获得，例如：骨髓、血液、脂肪组织。而外泌体，可以从几乎所有类型的细胞中获得。胎盘中也含有大量的外泌体。

通过上述科普，大家对外泌体美容一定有了更全面的认识

New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles

原文链接： Huilin Shao, Hyungsoon Im, Cesar M. Castro, Xandra Breakefield, Ralph Weissleder and Hakho Lee. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles. Chem Rev. 2018 Feb 28;118(4):1917-1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534.

该综述发表在Chemical Reviews杂志上，影响因子高达54.301分，对细胞外囊泡的研究方法总结非常全面，基本上目前EVs研究中用到的研究方法，这篇综述都有介绍，十分详尽！通讯作者是哈佛大学的Hakho Lee教授。

Extracellular Vesicles (EVs) 细胞外囊泡是由细胞主动释放的多样的纳米级膜囊泡。类似大小的囊泡可根据其生物发生、大小和生物物理性质进一步分类(如外泌体、微囊泡)。虽然EVs最初被认为是细胞碎片，因此未被重视，但现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信和疾病诊断和预后的循环生物标志物的重要载体。

该综述的内容包含：

生物流体（Biofluids）中含有大量的EVs，这些EVs可以从Parental Cells转移不同的分子去其他细胞，包括：蛋白，mRNA/miRNA，DNA等。

EV的形成决定了其膜组成。

微小囊泡的膜组成最能反映其Parental Cells(母细胞)的质膜。

相反，外泌体中已经鉴定出特异性的内体蛋白分子，这反映出外泌体形成的机制。内体分选复合物（ESCRT）已被广泛认为用于调节和引导特定分子进入MVB的腔内囊泡。ESCRT及其四个主要复合物（ESCRT 0，I，II和III）负责传递泛素化蛋白，用于溶酶体降解和蛋白回收。最近的研究表明，特定的ESCRT家族蛋白的耗竭可以改变外泌体的蛋白质含量和细胞释放外泌体的速率。更有趣的是，发现外泌体富含ESCRT系统的成分（例如TSG101和Alix），可用作外泌体识别的标记。

ESCRT不是介导外泌体形成的唯一机制。其他不依赖ESCRT的过程似乎也能以相互交织的方式参与其形成和分泌。外泌体也富含ESCRT非依赖性的分子。例如，四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81已被证明参与内体小泡运输。小GTP酶的Rab家族参与小泡运输和与质膜融合表明这些蛋白在释放外泌体中的作用。另外，外泌体中神经酰胺水平升高，抑制鞘磷脂会引起的外泌体释放减少，表明鞘磷脂酶与囊泡释放有关。

外泌体和微囊泡都包含核酸，包括miRNA，mRNA，DNA和其他非编码RNA。自从最初发现EV含有RNA，人们一直非常关注EV RNA用作诊断生物标志物。在开创性的工作中，Skog等人发现胶质母细胞瘤患者的血清外泌体含有特征性的突变mRNA（EGFRvIII mRNA）和miRNA，可用于提供诊断信息。这些核酸的发现导致了这样的假设，即EVs可以在细胞之间转移遗传信息。确实，瓦拉迪等人和Skog等表明，EV含有转移进入宿主细胞后仍然可以翻译的mRNA。EV中也有逆转座子和其他非编码RNA的表达。逆转录转座子序列和miRNA以及可翻译的mRNA都通过EV进行转移，这些成果突出了EVs作为遗传信息的载体和传播者的重要性。

虽然传统的光学显微镜的衍射极限接近EV的大小，但是不能产生清晰的图像。高分辨率EV图像需要通过电子显微镜(EM)或原子力显微镜(AFM)得到。然而，这些方法的通量有限，因为需要专门的染色方案和设备。

（a）扫描电子显微镜（SEM）提供三维的表面拓扑信息。

（b）透射电子显微镜（TEM）具有出色的图像分辨率，可结合免疫金标记一起使用来提供分子表征。

（c）冷冻电镜（cryo-EM）无需大量处理即可分析EV形态。

动态光散射 (DLS)，也称作 光子相关光谱 或 准弹性光散射 ，是一种物理表征手段，用来测量 溶液 或 悬浮液 中的 粒径分布 ，也可以用来测量如高分子浓溶液等复杂 流体 的行为。当光射到远小于其波长的小颗粒上时，光会向各方向散射（ 瑞利散射 ）。如果光源是 激光 ，在某一方向上，我们可以观察到散射光的强度随时间而波动，这是因为溶液中的微小颗粒在做 布朗运动 ，且每个发生散射的颗粒之间的距离一直随时间变化。来自不同颗粒的散射光因相位不同产生建设性或破坏性干涉。所得到的强度随时间波动的曲线带有引起散射的颗粒随时间移动的资讯。动态光散射实验易受灰尘或杂质影响，故样品的 过滤 和 离心 十分重要。

动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。

动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。 小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。

在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但是动态光散射技术由于是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。

纳米粒子跟踪分析(NTA) 是一种光学粒子跟踪方法，用于确定粒子的浓度和大小分布。用光束照射样品中的粒子。当粒子散射光并经历布朗运动时，摄像机记录下每个粒子的路径以确定平均速度和扩散率。与DLS的体散射测量不同，NTA跟踪单个粒子的散射。

然后，此信息将用于数学计算浓度（即视野中的粒子数量）和尺寸分布（即通过Strokes-Einstein方程的流体动力学直径，图5b）。 为了准确定量异质囊泡的浓度和大小，NTA程序需要精确优化摄像头和分析设置。 可能需要使用不同设置进行单独测量，以获取异质混合物中EV子集的准确读数。

EVs在大小、起源和分子组成上都是异质性的；除此之外，它们还存在于不同的复杂的生物流体中，包括血、胸腔积液、腹水、乳汁、唾液、脑脊液和尿液。这些流体中还含有大量的非囊泡大分子结构，可能会干扰EV的分析。所以EV的分离和富集显得尤为重要。

超速离心法（80%）和密度梯度离心法（20%）是最常见的两种高通量混合分离法。根据它们分离机制，这些方法可以分为三大类:密度、亲和和大小。

用不同的离心力将颗粒分离:以较低的离心力(300g)去除细胞碎片，而以较高的离心力(100000g)对EV进行沉淀和浓缩。尽管该方法是应用最广泛的金标准，但它也有许多缺点，如体积大、仪器昂贵、处理时间长、过程繁琐、被聚集的蛋白质和核蛋白颗粒污染以及需要大量的样品。

蔗糖梯度离心法是一种更为严格的超速离心法，它有助于进一步分离不同密度的囊泡，通常用于分离外泌体(悬浮密度为1.15至1.19 g/mL)。在这种方法中，一个包含不同大小囊泡和大分子的样品在一个密度从上到下递增的梯度表面上被分层。在离心过程中，不同的分子以不同的速率通过梯度沉积。由于其分辨率更高，该方法被认为可以分离更高纯度的EVs(特别是外泌体)；然而，它面临着许多与超速离心法相关的限制。更加新的等渗梯度(如碘黄醇梯度)法被认为效果更好。

最近，基于聚合物共沉淀法的商业试剂盒(例如，ExoQuick, Exo-Spin)已被开发用于EV富集。这些试剂采用降低EV的水合作用(从而降低溶解度)导致沉淀，然后在低离心力的情况下，沉淀的EV产物可以很容易地、重复性地分离出来，从而避免了长时间的超速离心法操作。然而，这些试剂盒对于大规模使用来说是昂贵的，而且对于EV来说缺乏特异性。该方法还容易产生非均相聚合物颗粒。由于这些试剂均降低了EV和蛋白质的溶解度，因此该方法还可共沉淀脂蛋白和Ago-2 RNA复合物。因此，共沉淀法作为EV分离方法受到了限制。

大小排阻色谱法根据它们的分子大小通过凝胶过滤来分离囊泡和其他分子。这种凝胶由含有特定大小分布孔隙的球形珠组成。当样品进入凝胶时，小分子扩散到孔隙中，而大分子则直接洗脱。因此，大分子比小分子更早地离开色谱柱，这使得分子的停留时间与色谱柱的大小相关联成为可能。近年来，该分离方法已被应用于从复杂的生物媒介中分离纯化囊泡。Sepharose, GE Healthcare; qEV, iZon等商业公司也正在开发商业的产品以简化EV富集，这些产品的排除柱都大约是75纳米孔径的树脂。蛋白质和其他较小的污染分子被滞留在孔径中，而较大的囊泡(75 nm)可以迅速通过并在空隙中被洗脱。大小排阻法可将EV与可溶性蛋白分离；为提高分离的效率和分辨率，需要考虑多种因素，包括介质类型、孔径、EV与介质之间的相互作用、柱的尺寸、柱的填充以及流速等。

为了提高复杂生物流体的EV分离效率和特异性，人们开发了多种新的EV富集方法。然而，与传统方法相比，这些新方法中的大多数具有较低的吞吐率，应加以解决使之变得实用。

基于分子大小的分离是一种很有潜力的方法，可以将EV与大型细胞碎片分离开来。各种微流体过滤系统已经被开发出来，用于从大的细胞碎片和蛋白质聚集物中分离EV，这些系统大部分是基于分子大小差异。例如,Rho等人构建了一种微流控设备，该设备使用膜过滤器对未处理的血液样本进行筛选，来分离EV。膜过滤器的大小∼1μm。在膜的下方插入一个毛细管，用于引导过滤后的EV进入收集通道。膜过滤器和毛细管导向器夹在两个环形磁铁之间；这种设置在进行大量的样品处理时可以方便地更换过滤器集。

Lee等人最近使用声波以无接触方式对EV进行细分。这种分离利用超声波驻波，根据囊泡的大小和密度对其施加不同的声交互作用力。该装置由一对相互交错的换能器(IDT)电极组成，用以产生跨流动通道的驻波表面声波。

EV蛋白主要来源于胞质膜、胞质醇，而非其他胞内细胞器(如高尔基体、内质网、细胞核等)。EV蛋白质的构成提示了囊泡的生物发生和cargo sorting(这个翻译有点怪)。因此国际细胞外囊泡组织建议应该仔细鉴定EV蛋白，特别是跨膜蛋白和胞质蛋白。

在哺乳动物中，跨膜蛋白和脂质结合的细胞外蛋白(如内贴蛋白)都与微囊泡和外泌体有关。外泌体的跨膜蛋白富含四聚体蛋白(如CD9、CD63和CD81)一个具有四个跨膜结构域的蛋白质超家族。四聚体蛋白参与细胞膜的转运和生物合成的成熟，在外泌体中高表达，这一特性使得四聚体蛋白被用于外泌体的定量和表征。然而，需要注意的是，四聚体蛋白并不只在外泌体中唯一表达。另一方面，微囊泡富含整合素、选择素和CD40配体，表明它们来自于细胞的质膜，EV富含特异的跨膜蛋白受体(如表皮生长因子受体/ EGFRs)和黏附蛋白(如上皮细胞黏附分子/EpCAM)。由于许多跨膜蛋白参与了正常生理和疾病的发病机制，它们被用作重要的病理生理学EV生物标志物。

EV相关的囊内蛋白具有多种功能。它们包括具有膜或受体结合能力的参与囊泡运输的胞质蛋白，如TSG101、ALIX、annexin和Rabs。EV还富含细胞骨架蛋白(如:内酯、肌凝蛋白和小管蛋白)、分子伴侣蛋白(如:热休克蛋白/HSPs)、代谢酶(如:烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶/GAPDH和核糖体蛋白)。有趣的是，最近的研究发现EV蛋白可以被受体细胞有效地运输和接收，从而在体内和体外引起强烈的细胞反应。这带来了EV作为治疗和药物载体的新机遇。

EV蛋白的定量和特征鉴定不仅对阐明EV的生物发生和cargo sorting有重要意义，而且对鉴别生理和病理标志物也有重要意义。然而，传统的蛋白质分析，包括Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)，通常需要大样本量、大量处理和/或庞大的专门仪器，因而不太适合临床应用。

在EV蛋白评估时，Western blotting可能是最常用的技术，用于提示与EV相关的靶蛋白的存在。在这个过程中，纯化的囊泡制剂(通常通过现行的梯度超离心法金标准制备)可以用含有变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲裂解液进行处理。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS−PAGE)分离蛋白裂解物，然后转移到膜上，对特定的蛋白target进行免疫印迹。虽然这种方法有很长的准备和处理时间( 10h)，但是Western blotting可以提供关于蛋白质分子大小的有用信息。

不像Western blotting，ELISA只能在相对较小的范围内对目标蛋白进行定量，质谱分析可实现高通量肽谱分析。纯化的EV制剂经过酶消化和肽分离，然后用质谱仪电离分析。在这个复杂的过程中，多个步骤严重影响EV蛋白组学分析。除了有效的EV纯化，质谱分析之前的肽分馏被认为是鉴定囊泡蛋白的一个重要前提。通常通过三种主要方法实现：(1)SDS−PAGE，(2)二维液相色谱和(3)基于等电聚焦的分馏。

值得注意的是，既然质谱分析可以鉴定消化后的肽片段，那么适当的蛋白质鉴定、定量和验证是必要的。已经有两种用于定量的技术方法：基于标签的和无标签的。在基于标签的定量分析中，标签(等压或同位素)被用于比较分析。无标签的定量分析中，色谱强度的谱计数被应用。识别出的候选蛋白可以使用其他传统的蛋白质技术如Western blotting进行验证。在检测灵敏度方面，质谱法通常不如基于抗体的技术敏感。

虽然质谱分析需要大量的准备和处理时间(数天)，但它可以提供高通量、定量和EV比较蛋白质组分析。到目前为止，已有成千上万的囊泡蛋白被系统分类，蛋白质-蛋白质相互作用分析。基于质谱的哺乳动物和细菌EV的蛋白质组学分析的详细讨论已经在一些综述中被强调。这些网络和相互作用的研究有助于阐明EV载体的功能活动及其在细胞间远距离通信中的重要作用。

为了解决EV蛋白质定量相关的技术挑战，新一代生物传感器正在开发中。与传统的蛋白质检测方法相比，这些生物传感器利用独特的传感机制，可以检测各种大小和分子含量的EV。这些技术中的许多只需要更小的样本量和更少的样本处理过程，因此非常适合于医疗应用。

流式细胞术是一种基于光散射和荧光激活来分选单个大颗粒(如细胞或微米大小的实体)的强大的技术，然而，传统的流式细胞术对检测直径小于500 nm的小颗粒的灵敏度和分辨率有限。此外，它还受到高光学背景的影响，由于鞘层流体中存在小颗粒(约200 nm)。用传统流式细胞术量化EV时，大量的小EV可能被忽略或者计数偏低：可能同时有多个小的囊泡被照亮被计数成一个单独的事件，这种现象被称为“群体理论”。

为了解决传统流式细胞术的弊端，微米大小的乳胶珠被用来绑定多个囊泡。然后用荧光抗体对结合的EV进行染色，并对其蛋白标记物进行鉴定。然而，这种方法缺乏分析单个囊泡的能力，并且不能区分不同的囊泡亚群，这可能会导致特征的丢失。

该技术主要基于磁性纳米粒子(MNPs)。由于大多数生物物质天然缺乏铁磁背景，这种传感几乎不受同系统中其他生物样品的干扰。因此，即使光学上浑浊的样品对磁场也是透明的；当靶分子被特定的MNPs靶向时，它们与自然的生物背景形成了强烈的对比。在基于核磁共振(NMR)的磁检测中，MNPs置于NMR磁场中，产生局部磁场，改变周围水分子的横向弛豫率，放大分析信号。因此，核磁共振减少了样本处理过程，提高了检测灵敏度，已经被开发用于多个医疗点应用(例如，直接从血液样本中检测循环肿瘤细胞和细菌)。

但是将这种技术运用在EV检测上却遇到了挑战，因为EV明显比肿瘤细胞小1到2个数量级。Shao等人开发了一种专门用于EV检测和蛋白质分析的新分析技术。此方法采用两步生物正交点击化学方法来标记EV，这种小分子(200 Da)标记策略并没有显著增加抗体或MNP的大小，从而提高了从非结合抗体和MNPs中保留目标囊泡的效率。使用微流控芯片上微核磁共振(μNMR)直接测量EV来确定EV生物标志物的丰度。

相比传统的蛋白技术，μNMR系统表现出更好的检测灵敏度：比WB和ELASA灵敏10 3 倍。Shao等人利用这种集成技术可研究在培养皿中生长的多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系中的EV。比较蛋白分析证实，EV确实反映了其亲代细胞的蛋白概况，组合GBM的四种标志物(EGFR、EGFRvIII、PDPN和IDH1)

R132H)可用于区分癌症来源的EVs与宿主细胞来源的EVs。

鉴于EV的尺寸小，一种新的快速无标签EVs检测方案：表面等离子体共振(SPR)被提出。SPR是指在入射光照射下，金属介电界面上传导电子的集体振荡。不同于其他基于时敏荧光和化学发光探针的光学检测方法，SPR传感检测金属-介电介面附近生物分子结合相关的局部折射率变化，应用于无标签和实时检测。

RNA是EV携带的主要核酸。与细胞中的RNA相比，eEV运输的RNA通常更短(通常200个核苷酸，但也有长达5 kb的)。它们主要是非编码rna，包括microRNA(miRNA)、tRNA (tRNA)、长链非编码RNA (lnRNA)和片段化的mRNA。编码mRNA (mRNA)已在长度为200~1000个核苷酸的转录组中被识别。mRNA可以翻译成蛋白质，而miRNA可以调节受体细胞中靶mRNA的翻译。EV中RNA的数量和性质可以根据其来源的细胞类型而变化。

由于它们在受体细胞中保留了功能，研究人员提出了有趣的假设，即可能存在专门的机制将不同的RNA分配给EV运输到特定的受体细胞，或可能利用这些机制运送治疗性RNA到特定的部位。这是一个活跃的研究领域，已经有一些综述对其进行阐述。

近年来的研究发现，EV中含有相当比例的母细胞的mRNA，其中许多是细胞特异性的mRNA。这些mRNA分子通常以片段的形式存在于EV中，保护其不被RNA酶降解，使它们成为强有力的循环生物标志物。

此外，已在多个研究中得到证实：EV中一些2 kb的mRNA分子能够编码支持蛋白质合成的多肽(即，蛋白质翻译的功能)。这些研究强调了EV作为特定的细胞信使在影响受体细胞和促进细胞间通讯等多方面的作用。

miRNA是一类小的非编码rna(一般为17 - 24个核苷酸)，通常通过靶向mRNA的3’非翻译区介导转录后基因沉默。通过抑制蛋白质的翻译，EV miRNAs在许多生物过程中都是强有力的调控因子。不同于EV中的循环mRNA，miRNA可以以多种稳定形式存在于体液中。除了被包裹在EV中，循环miRNA还可以被加载到高密度脂蛋白或结合到囊泡外的AGO2蛋白上。目前的证据表明，虽然大多数循环miRNA都与RNA结合蛋白相结合，但在EV中也能发现少量的miRNA。然而，miRNAs在EV中的分布仍不清楚。与mRNA的情况一样，EVs中的miRNA表达反映了其细胞来源，但与亲代细胞略有不同。一些miRNA已被发现优先表达在EV中，并在受体细胞中保持功能以调节蛋白翻译。最近的研究还发现，在哺乳动物细胞培养中常用的胎牛血清可能在体外EV制备过程中导致miRNA伪影。

通过NGS，我们还发现有其他类型的RNA存在EV中。这些RNA包括tRNA，rRNA，小核RNA(snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)以及长链非编码RNA (lncRNA)。参见上表。

最近的研究表明某些EV可能含有DNA片段。这些DNA是双链片段，范围从100个碱基对(bp)到2.5 k bp，EV外部还有一些与之相关的2.5k bp的DNA片段。这些片段代表整个基因组DNA，可用于鉴定亲代肿瘤细胞中存在的突变。虽然有可信的证据表明在EV中存在DNA，但其功能尚未确定。

EV核酸作为一种潜在的循环生物标志物和受体细胞间的调节因子已被广泛研究。传统的核酸提取和分析工具已经成功地为我们理解EV核酸奠定了重要的基础。由于EVs中核酸的含量较低，开发高效的提取方法和灵敏的检测策略是非常重要的，特别是在小样本中对稀有目标分子进行检测。

随着人们对利用EV核酸作为微创诊断标记的兴趣日益浓厚，新的生物传感器技术已被开发出来，使提取和分析变得更加高效、快速。这些新平台中有许多提供了对目标核酸标记的敏感定量，并且能够在复杂的生物学背景下识别疾病标记，甚至包括单核苷酸点突变。这为个性化临床医疗开辟了许多新的机会。

虽然传统PCR是检测基因/转录突变的强大技术(例如，EGFRvIII缺失突变)，但其敏感性有限，其在检测单核苷酸突变方面存在很多不足。这个问题与EVs特别相关，因为在野生型转录本的大背景中，突变转录本的比例很低。Chen等人最近采用了一种液滴数字PCR (ddPCR)技术来检测EV中的罕见突变。

Shao等人最近开发了一种综合微流控平台，用于现场EV核酸分析，该平台集成了三个功能模块：靶向富集EVs，芯片上RNA分离，实时RNA分析。这个平台被称为免疫磁性外泌体RNA(iMER)分析平台：利用抗体功能化的磁珠从宿主来源的囊泡中分离癌症特异性EVs，然后在芯片上裂解免疫磁珠吸附的囊泡。当EV裂解液通过玻璃珠过滤器时，选择性吸附EV RNA并从过滤器中洗脱，用于反转录和qPCR分析。为了简化分析过程，所有关键部件都集成到一个芯片盒中。

随着该系统的发展，作者研究了核蛋白的两个mRNA靶标，MGMT(6-甲基鸟嘌呤)

肿瘤是一种复杂的结构，包括恶性细胞和周围的基质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。最近的研究表明，EVs在肿瘤微环境中促进细胞间通讯，从而调节疾病的发生、发展，并且在治疗反应方面发挥重要作用。

这一大块儿的其他内容大家感兴趣的话可以阅读原文献。

在大多数神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆)中存在类似的疾病进展模型，其中错误折叠的蛋白质自结合形成有序的聚合体并在细胞中聚集。阿尔茨海默病(AD)中，淀粉样蛋白的Abeta肽的形成可能是这些蛋白聚合体中最著名的。帕金森疾病(PD)中，另一种类型的聚合体在细胞内形成，主要由alpha-synuclein(突触核蛋白)组成，称为路易小体。最近的研究表明，许多神经退行性疾病中涉及的错误折叠蛋白出现在EV中。因此，这些囊泡为检测和监测神经退行性疾病带来了新的希望。

AD是一种迟发性神经系统疾病：由于神经变性而导致记忆和认知能力的逐渐丧失。虽然AD的确切病因仍是一个有争议的话题，但很明显，与Aβ肽相关的斑块沉积和与tau蛋白相关的神经纤维缠结对疾病的进展是非常重要的。这些淀粉样肽来源于淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解过程。这一

早期胃癌和癌前病变的诊断新方法，与旧方法比有哪些优势？

早期胃癌内镜或手术治疗的总生存率可超过 96%，而西方世界的大多数胃癌病例都是在晚期确诊的，累积 5 年生存率范围为 20-40%。通常，早期胃癌没有任何症状，因此降低晚期胃癌死亡率的办法是及时发现，无论是通过胃镜检查还是无创检查。

传统肿瘤标志物

癌胚抗原 (CEA) 和传统肿瘤标志物，即糖类抗原 72-4 (CA 72-4)、糖类抗原 19-9 (CA 19-9)、糖类抗原 15-3 (CA 15-3) 和糖类抗原12-5 (CA 12-5)主要用于治疗监测和预后判断，而不是早期检测或筛查胃癌。尽管在胃癌中可以发现它们的水平升高，但它们既不敏感也不特异，而且它们通常在疾病晚期升高。

胃黏膜萎缩标志物

胃蛋白酶原

胃蛋白酶原可在血液中作为胃粘膜变化的间接标志物进行测量。 胃蛋白酶原 I (PgI) 和胃蛋白酶原 II (PgII) 两种同工酶原在胃的不同部位产生。胃蛋白酶原I 的产生仅限于胃体（近端胃）的分泌酸的腺体，而胃蛋白酶原II广泛存在于整个胃的不同类型的腺体以及十二指肠的 Brunner 腺体中。 粘膜炎症的存在，以及幽门螺杆菌感染，可能会增加 胃蛋白酶原I 和 胃蛋白酶原II 的水平，并且在某些情况下，当萎缩和炎症都存在时，会导致胃蛋白酶原I 值正常。 考虑到这一缺点，胃蛋白酶原I 与 胃蛋白酶原II 的比率降低 (胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原II) 被认为是胃萎缩的最佳血清学标志物。

应该认识到，胃蛋白酶原检测正在使用不同的方法（乳胶凝集、ELISA、化学发光酶免疫测定）。 尽管使用不同方法获得的结果之间存在良好的相关性，但在绝对数字中，结果可能会有所不同。 因此，必须针对所使用的方法专门确定临界值，可能还要在不同人群中进行调整。

一些荟萃分析已经解决了胃蛋白酶原检测在胃癌检测中的准确性。初步荟萃分析包括 42个数据集，包括基于人群的筛查研究，涉及 296,553 个人。包括来自亚洲（主要是日本）的多项研究。在评估胃蛋白酶原对胃癌检测的性能时考虑了 25 项研究。 合并胃癌的敏感性为 77.3%，特异性为 73.2%。另一项荟萃分析包括1520例胃癌 案例。结果表明，胃蛋白酶原I/胃蛋白酶原II 检测癌症的汇总敏感性为 0.69，特异性为 0.73。

胃泌素17

最近提出了一个额外的标志物来表征胃窦部分的萎缩：胃泌素 17 (G-17)，因为它仅由器官这一部分的 G 细胞分泌。 当存在胃窦部萎缩时，G-17 水平预计会降低； 然而，萎缩的受试者的水平可代偿性增加 。 此外，循环中的 G-17 水平对生理刺激敏感，包括食物和药物摄入（例如质子泵抑制剂类胃药）。 这将检测胃窦部萎缩的测试值降低到远低于筛选测试可接受的灵敏度水平。 在近端和远端局部胃癌之间也没有发现 G-17水平的差异。 因此， 目前从研究该指标用于胃癌筛查的作用有限。

G-17 经常与胃蛋白酶原和幽门螺杆菌血清抗体检测联合使用。荟萃分析总结了在萎缩性胃炎中的研究结果，但不是针对胃癌检测的结果。 分析涉及 4241 名受试者，合并的敏感性为 74.7%，萎缩的特异性为 95.6%。

自身免疫性胃炎的标志物

自身免疫性胃炎患者发生胃癌的风险增加，因此建议识别这些人群并进行监测。 尽管自身免疫性胃炎的血清学检测在常规中被广泛使用，但目前还没有针对这种情况的无创检测策略的“金标准”。

胃壁细胞抗体(APCA)是质子泵 a 和 b 亚基的靶标，也被认为是胃粘膜萎缩的标志物。 胃壁细胞抗体被认为是自身免疫性胃炎的标志物，胃壁细胞抗体的存在与胃体部分的萎缩有关； 它们可能先于作为恶性贫血的胃体炎的临床表现。

内因子 (IF) 是由位于胃体和胃底的壁细胞（泌酸细胞）产生的糖蛋白。 抗内在因子抗体 (anti-IFA) 已被视为恶性贫血的标志物，出现在萎缩性胃炎的后期。 抗 IFA 似乎非常特异，但对萎缩性胃炎检测的敏感性较低。

因此，目前自身免疫性胃炎和相关疾病的诊断策略包括上述血清学标志物以及巨细胞性贫血的存在，检测低维生素 B12 水平、幽门螺杆菌状态和胃粘膜组织学评估。

新兴的基于血液的生物标志物

在过去的十年中，出现了各种其他基于血液的生物标志物检测，通常称为液体活检。 液体活检是用于分析癌细胞或癌细胞衍生分子的血液或其他生物流体样本。 它们是传统组织活检的一种非常有前景的替代方法，可用于癌症的早期检测和随后的预后、监测疾病进展和跟踪肿瘤演变。 液体活检中最常见的分析物是循环肿瘤细胞 (CTC) 和循环无细胞核酸，包括循环肿瘤 DNA、甲基化标志物、无细胞 mRNA、miRNA、lncRNA 和其他 RNA 种类。 最近，细胞外囊泡 (EV) 已成为液体活检的癌症衍生生物标志物的替代来源。

循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞是从原发性或转移性肿瘤脱落到癌症患者外周血中的播散性癌细胞。 它们可能以单个细胞或 2-50 个癌细胞簇的形式存在，并且代表血液转移的重要步骤。 虽然几项研究一致证明 循环肿瘤细胞 的计数和/或分子分析可用于预测 胃癌 患者的总体和无进展生存期以及监测治疗反应，但目前，它们与 胃癌 早期检测的相关性存在争议。 循环肿瘤细胞 是一种罕见且异质的肿瘤细胞群； 因此，不同的 循环肿瘤细胞 检测方法产生了不同的检测率。 多项研究表明，胃癌患者血液中的循环肿瘤细胞检出率和循环肿瘤细胞数量低于其他癌症 ，如前列腺癌或乳腺癌，从而构成了利用它们进行早期检测的生物屏障。研究人员使用 CellSearch 系统（美纳里尼硅生物系统公司，美国）发现，只有三分之一的可切除胃癌患者每 7.5 mL 血液中至少含有 1 个 循环肿瘤细胞。使用基于尺寸的分离技术，发现在 I 和 II 阶段的 胃癌 中，循环肿瘤细胞 检测率分别为 33.3% 和 50%。另一项研究表明，转移性疾病患者的循环肿瘤细胞 数量明显高于非转移性疾病患者，并且与晚期肿瘤分期相关。 同时，使用称为“FAST 盘”的离心微流体系统，该系统基于通过膜孔对 循环肿瘤细胞 进行大小选择性分离，在 80% 的 T1 期和 N0 期 胃癌 患者中检测到 循环肿瘤细胞。使用基于过滤的方法，然后与上皮和间充质转录物的探针进行多重 RNA 原位杂交，表明在 胃癌 患者血液中发现的大多数 循环肿瘤细胞 具有间充质表型。 当同时计算上皮细胞和间充质细胞时，淋巴结阴性 胃癌的检出率为 77.3%，无远处转移的患者的检出率为 83.3%。 具有间充质表型的 循环肿瘤细胞 无法通过基于捕获表达上皮标志物（如 EpCAM 或细胞角蛋白）的细胞的方法检测到，因此在使用 CellSearch 系统或类似方法的研究中可能低估了 循环肿瘤细胞 的数量。 总之， 最新研究表明循环肿瘤细胞可能具有早期检测胃癌的潜在用途，捕获和分析异质循环肿瘤细胞群体的新方法值得进一步研究。

循环肿瘤DNA

DNA 片段从体内的各种细胞类型释放到循环中。 在癌症患者中，一部分无细胞 DNA (cfDNA) 来自肿瘤细胞，称为循环肿瘤 DNA (ctDNA)。 循环肿瘤 DNA 可用于检测肿瘤细胞中的体细胞点突变、重排、拷贝数变异和甲基化标志物，因此可用于癌症的非侵入性检测、监测治疗反应和疾病进展以及跟踪肿瘤内异质性和进化。 已在晚期和早期癌症患者中检测到 循环肿瘤 DNA，但是早期癌症患者 cfDNA 总库中循环肿瘤 DNA的比例通常很低，这代表了使用基于循环肿瘤 DNA 的主要技术挑战用于癌症早期检测的测试。 大多数分析循环肿瘤 DNA 的研究都使用基于 PCR 的方法或基于下一代测序 (NGS) 的方法。

液滴数字 PCR (ddPCR) 允许对生物流体样本中含有突变的 DNA 片段进行绝对定量，检测限低于野生型等位基因背景中 0.1% 的变异等位基因分数 (VAF) . 它是跟踪已知点突变和拷贝数变异的首选方法，例如患者的 HER2 扩增已经被诊断出患有胃癌。 然而，它需要对肿瘤突变情况的先验知识，因此它在早期检测或筛查方面的潜力有限。

相反，基于 NGS 的方法允许检测 循环肿瘤 DNA中的肿瘤特异性遗传或表观遗传改变，而无需事先了解肿瘤中存在的改变，因此对于检测癌症的存在和跟踪癌症的克隆进化，治疗或疾病进展期间的癌症具有潜在的相关性。然而，传统 NGS 方法的检测限约为 1% 的 VAF，当 循环肿瘤 DNA 比例相对较高时，这足以跟踪晚期疾病中的肿瘤突变，而如果 循环肿瘤 DNA 比例较低，则不适合。 因此，基于 NGS 的技术需要优化和改进以适用于早期癌症的检测。 最近，已经开发了几种用于检测可切除癌症的新型基于 NGS 的血液测试。

CancerSEEK 是一种血液检测，可以通过评估循环蛋白水平和 循环肿瘤 DNA 突变来检测八种常见的癌症类型，包括 胃癌。该检测在 1005 名患有卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠直肠癌、肺癌或乳腺癌的可切除 I-III 期癌症患者和 812 名 健康 个体中进行了测试。 结果显示，检测卵巢癌和肝癌的灵敏度为 98%，检测 胃癌 的灵敏度为 70% 左右，而特异性大于 99%。 重要的是，CancerSEEK 测试可以在 63% 的病例中正确识别癌症的解剖部位（并且在 83% 的病例中定位到两个可能的解剖部位）。

另一种最近开发的血液测试称为 PanSeer，它基于通过靶向亚硫酸氢盐测序检测 循环肿瘤 DNA 中癌症特异性甲基化模式。 该测试询问了 595 个已知包含差异甲基化 CpG 位点的基因组区域，这些位点可以将癌症与 健康 组织区分开来。 当应用于诊断后的血浆样本时，它可以检测五种常见的癌症（胃癌、食道癌、结直肠癌、肺癌或肝癌），灵敏度为 88%，特异性为 96%，而不管其来源如何。 此外，早期和晚期癌症的敏感性相似。 接下来，对 605 名无症状个体（其中 191 人在抽血后四年内被诊断出患有这些癌症类型之一）的检测显示，诊断前血浆样本的敏感性为 95%。 因此，这项研究表明，包括胃癌在内的常见癌症在使用标准护理方法进行诊断之前最多可以检测四年。

另一个必须考虑的方面是 cfDNA 中的一小部分遗传改变可能来自与年龄相关的克隆造血扩增。 为此，开发了一种策略来区分 循环肿瘤 DNA 改变和与克隆造血相关的变异。 来自 50 名可切除 胃癌 患者的匹配 cfDNA 和白细胞的靶向深度测序 (30 000) 显示 62% 的患者存在白细胞衍生的序列改变。 重要的是，在 白细胞中最常受影响的基因是 DNMT3A (45%)、TP53 (29%)、EGFR (10%)、APC (6%) 和其他常见的癌症基因，这些变异的中位 VAF 为 0.31%，这类似于癌症特异性变异。过滤白细胞衍生的变异后，54% 的患者发现 cfDNA 中存在癌症特异性突变，这与手术后疾病复发密切相关。

总之，最近的研究表明，通过 循环肿瘤DNA 分析检测早期 胃癌 是可行的，并且最近开发的一些检测方法显示出非常高的灵敏度和特异性。 然而，必须去除源自 白细胞克隆扩增的混杂序列变异，以识别真正的癌症衍生序列变异，并且应在将此类检测整合到常规临床实践之前证明其临床实用性。

无细胞RNA

2008 年，一项原理研究证明， 表明 miRNA 从癌细胞释放到血流中，在那里它们受到保护，不会降解，并且很容易通过基于 PCR 的方法检测到 。 与此同时， 人血清中含有不同的疾病特异性 miRNA 模式，这些模式在 健康 对照中是不存在的，并表明几种疾病可能会在患者血液中留下特定的 miRNA 指纹 。 从那时起，在癌症患者的各种生物体液中研究了个体 miRNA 或 miRNA 特征的水平，并与疾病状态、阶段、侵袭性和对治疗的反应相关联。 大约一百篇出版物报道了在胃癌患者中检测循环无细胞 miRNA。 其中一些研究报告了 miRNA 面板的鉴定，显示出非常高的诊断价值。

然而，在多项研究中，少数 miRNA 显示出一致的结果，而许多其他 miRNA 的报道结果相互矛盾。 结果不一致和重现性差的主要原因是队列规模小、前瞻性研究缺乏验证、RT-qPCR 结果的不同归一化方法以及血液样本收集和处理的可变条件。

最近，发表了一项广泛的三阶段研究，以解决早期研究的缺点。在第一阶段，通过 RT-qPCR 在 236 个 胃癌 病例和 236 个匹配的对照受试者中量化了 578 个候选 miRNA。 在第二阶段，在 AUC 为 0.92（I-II 期 胃癌 的 AUC 为 0.91）的两个独立病例对照队列中，选择并验证了一组显示最高 AUC 的 12 个 miRNA，分别为 89 和 121 名受试者。 最后，在 4566 名参与者的前瞻性验证队列中制造并验证了临床级 12-miRNA 检测，这些参与者接受了胃镜检查和基于血清的 胃癌 检测生物标志物测试（幽门螺杆菌血清学、胃蛋白酶原 I/II、Pg 指数、CEA 和 CA19-9）。 12-miRNA 面板将 胃癌 与 健康 对照区分开来，AUC 为 0.848（灵敏度为 87%，特异性为 68.4%），而其他生物标志物测试显示 AUC 范围为 0.647（ABC 方法）至 0.576（Pg 指数和 CEA）。 因此，该检测明显优于目前可用的测试，并且有可能用作胃癌 的风险评估工具和高风险人群的筛查工具。

此外，许多研究 探索 了使用其他 RNA 种类的可能性，例如 mRNA、长链非编码 RNA (lncRNA)和环状 RNA (circRNA)作为基于血液的胃癌 的生物标志物。 其中一些研究已经确定了显示出与上述 miRNA 面板相似的诊断性能的 RNA 生物标志物特征。 例如，剖析lncRNA 在匹配的术前和术后血浆、5 名 胃癌 患者的肿瘤和正常胃组织中的 lncRNA 的检测结果导致 5-lncRNA 指数的鉴定，随后在 321 名受试者中进行了测试，可用于区分 胃癌 和 健康 对照，激用于区分 胃癌 和癌前病变。 手术后 lncRNA 指数下降，表明血浆中这些 RNA 的主要来源是肿瘤组织，该指数适用于监测肿瘤动态。 综上所述， 这些研究提供了一个原理证明，即各种编码和非编码 RNA从癌组织释放到血液中 ，但是，需要进行大型前瞻性临床研究并与现有生物标志物进行比较，以评估其临床效用。

细胞外囊泡

“细胞外囊泡”是指从细胞自然释放到细胞外空间的各种膜结合囊泡，包括外泌体、微囊泡和凋亡小体。 细胞外囊泡 包含各种蛋白质、脂质、代谢物和各种编码和非编码 RNA，甚至 DNA 片段。 在包括 胃癌 在内的各种癌症患者的生物体液中发现 细胞外囊泡 水平增加，但仍不清楚这些 细胞外囊泡 是由癌细胞本身产生还是代表对疾病或治疗的全身反应。 此外，在患有各种非癌症疾病和生理应激状况的患者的血液中发现细胞外囊泡水平增加，因此细胞外囊泡 水平本身似乎不是癌症的高度特异性生物标志物。 细胞外囊泡 可能是液体活检中癌症衍生生物标志物的来源。 细胞外囊泡可能比循环肿瘤细胞、ctDNA 或基于 cfRNA 的液体活检有几个优势：(i) 细胞外囊泡比循环肿瘤细胞更丰富，因此可能比循环肿瘤细胞更好地反映肿瘤内异质性； (ii) 它们保护其货物免于降解，因此可能是比总血浆或血清更稳定的 cfDNA 和 RNA 来源，以及 (iii) 它们包含让人联想到其亲本细胞的分子特征，并且可能富含低丰度但高度特异性癌症生物标志物。

总结：

不推荐传统的肿瘤标志物（如 CEA、CA 19-9、CA 72-4 等）作为独立检测指标用于早期胃癌非侵入性检测。

研究最多的胃癌前病变标志物是胃蛋白酶原（Pg I、Pg I/II），然而，这些不能被视为癌症检测，但可用于识别监测风险增加的人群。 应该对癌前病变的检测进行额外的研究，以提高敏感性。

基于癌症特异性甲基化模式、循环蛋白和循环肿瘤 DNA 突变以及 多种组合miRNA 面板检测的方法已经证明了有希望的结果，使这些更接近实践，而基于循环检测的测试肿瘤细胞、细胞外囊泡和无细胞 RNA 需要更广泛的研究。

总之，对于胃癌或高风险癌前病变的完美检测方法的需求尚未得到满足，需要更多的研究来满足这一需求，目前早期胃癌的诊断还是需要靠胃镜检查来明确，其他方法并不可靠。

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。 

特发性婴儿动脉钙化的基因治疗模拟

研究背景

特发性婴儿动脉钙化（IIAC）是一种罕见的常染色体隐性疾病，此种遗传病父母双方均为致病基因携带者，血缘关系会增加患该疾病的风险。到目前为止世界约报到了约二百多例患者，集中在产前诊断和新生儿期诊断。

特征：主动脉、冠状动脉和肾动脉钙化。心肌肥大和冠状动脉弯曲。镜下可见中、大动脉内弹性板内弥漫性羟基磷灰石沉积，并伴有肌内膜增生和狭窄。

80%的病例发现外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（ENPP1）基因功能缺失突变。

病因

ENPPl 基因产物为外部核苷酸焦磷酸酶／磷酸二酯酶，该酶使血管平滑肌细胞、软骨细胞及成骨细胞产生无机焦磷酸(PPi)。PPi 有许多生物活性，包括调节血管平滑肌细胞分化和抑制软组织钙化。

ENPPl 基因突变可以导致 PPi 水平下降，产生羟磷灰石结晶，沉积在动脉的各个部位，包括主动脉、冠状动脉、心脏瓣膜、肾动脉等，并引起血管病变，最终导致 IACI

危害

其大多数患者在生命的头6个月内死亡，少数可致成年。多是由于心肌缺血、心脏衰竭死亡。

研究进展

诊断检查：凡患有新生儿持续性肺动脉高压，严重全身性高血压和回声血管的新生儿，均应考虑婴儿的特发性动脉钙化。重要的诊断发现是钙化的大中型动脉，包括主动脉，冠状动脉，肺、肾和肾内动脉。胸部和腹部X线和CT上发现动脉壁钙化作为诊断依据。

治疗方法：没有明确的治疗方法。目前仅对症状治疗，如必要的高血压治疗。一些报告指出，使用双膦酸盐（最常用的是依替膦酸盐）似乎可以提高生存率。

基因治疗背景

基因疗法：基因治疗（Gene Therapy）是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。

技术：CRISPR/Cas9等基因编辑

载体：病毒载体（AAV、LV），非病毒载体（脂质体、纳米粒）

技术路线

1、体液候选核酸筛查：a.全基因测序； b  血小板转录组测序；c  血液外泌体转录组测序；d  尿液外泌体转录组测序。

2、算法筛选并验证基因靶点： a.算法分析出候选的靶点； b . RT-PCR在样本外泌体中验证该靶基因的变化；c.ELISA样本外泌体中 验证该靶蛋白的变化。

3、开发现场筛查的方法：a  实验室检测LAMP/RPA对该基因靶点的检测灵敏度及特异性；b  芯纸/芯桶中检测到该靶点基因的灵敏度及特异性。

4、真实世界研究人群筛查该疾病的发生率。

什么是外泌体_外泌体是什么？

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。