肿瘤细胞外泌体调控巨噬细胞极化（抑制肿瘤细胞增殖）

本文目录一览：

• 1、Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移
• 2、什么是外泌体？
• 3、非因推荐 | 肿瘤微环境研究大剖析——肿瘤相关巨噬细胞
• 4、骨肉瘤免疫微环境中的巨噬细胞：对免疫治疗的影响
• 5、巨噬细胞极化中的作用
• 6、什么是肿瘤相关巨噬细胞

Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移

前言

肝细胞癌（HCC）是世界上第五大常见癌症，以及全球癌症死亡的第五大原因。大部分HCC患者出现转移，其中肺转移的总体生存率约5.9月，无转移患者总体生存率约16.2月。肺转移在恶性肿瘤中的发病率约25%-30%，HCC患者发病率约41.6%-43.6%。

肿瘤细胞与相应微环境的相互作用以及基质细胞参与肿瘤进展的重要性。肿瘤的基质细胞有内皮细胞，纤维母细胞，肿瘤浸润的炎症细胞，这些细胞创造微环境，改善肿瘤细胞的特性，调控肿瘤的发展及对治疗的应答。研究表明，肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）可以加速肿瘤的发生、发展。巨噬细胞根据极化特性分为M1和M2型，M1型巨噬细胞能够分泌促炎症和免疫刺激因子，TAMs比较接近M2型巨噬细胞，可以激活产生Th2细胞因子。TAMs加速癌细胞转移以及癌细胞与TAMs对话的潜在机制有待进一步阐明。

外泌体是一种包含蛋白、核酸、脂质的微小囊泡，参与肿瘤微环境中不同类型细胞间的物质运输、信息传递。由于TAMs外泌体与肿瘤的研究是有限的，所以TAMs外泌体对肿瘤的发生发展和转移也需要进一步探索。

最近发表于Hepatology杂志（IF=14.679）的研究指出，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来源的外泌体介导CD11b/CD18蛋白转移到肿瘤细胞，可能增强了肝癌细胞迁移能力，为肿瘤转移机制提供新的见解。

◆ 技术路线 ◆

在这项研究中，研究人员获取120例肝癌vs. 癌旁，转移vs. 非转移临床样本，CD206、CD68在肝癌和HCC非转移组织样本中表达显著升高，且CD206、CD68高表达患者预后较差。

功能上，M2型巨噬细胞/M2型巨噬细胞条件培养基与肝癌细胞共培养，促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

PKH26染色示踪肝癌细胞吞噬外泌体效率；M2型巨噬细胞来源外泌体（M1 exos）介导肝癌细胞迁移和侵袭；GW4869（外泌体抑制剂）逆转迁移和侵袭表型。

体内实验表明，巨噬细胞来源外泌体预处理肝癌细胞，尾静脉接种到小鼠。与对照、M1 exos相比，M2 exos组肺转移显著增强；GW4869可以逆转体内肺转移表型。另外，M2 exos组总体生存时间也显著降低。M2 exos增强HCC细胞侵袭能力，可能是巨噬细胞和肝癌细胞之间的一种新的信息传递模型。

蛋白质组学测序：M2 exos 组显著上调的蛋白有：FGL2，FABP4, CD37, ITGB2 (CD18 or β2 integrin), ITGB5, and ITGAM (CD11b or αM integrin)。体内和体外研究结果表明，CD18 、CD11b在M2 exo中高表达，可通过M2 exo传递到HCC细胞；CD18 、CD11b抗体阻断后迁移和侵袭能力也下调，小鼠存活时间延长。

前期研究结果表明，在肿瘤发生的初期，MMPs降解胞外基质介导肿瘤的侵袭和转移。研究者通过WB、qPCR、ELISA实验发现M2 exo处理的肝癌细胞中MMP-9表达上调，CD18 、CD11b抗体阻断后MMP-9表达量下调；MMP抑制剂（MMPi）或联合M2 exo处理肝癌细胞，其迁移和侵袭力下降；另外MMPi处理的肝癌细胞接种小鼠，肺转移数目显著降低。

总之，本研究阐明了M2 exo传递αMβ2到肝癌细胞，激活受体细胞表达MMP9，从而促进肝癌转移。

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什么是外泌体？

什么是外泌体

人到中年，最难以启齿的矛盾便是脸上越来越多的皱纹和内心与日俱增的

“抗老需求”之间的矛盾。为了今天的容颜不被明天改变，什么玻尿酸、水光针甚至是干细胞美容，我都勇于“尝鲜”。而作为美容界的后起之秀——“外泌体”，我更是不愿错过。毕竟它虽然是近两年兴起的美容模式，但其发展历史也已经有40多年了，而它的美容功效更是有口皆碑，比干细胞美容有过之而无不及，一时间，关于外泌体美容的宣传铺天盖地，可谓是风头无两，颇有“江湖大佬”的地位。但也正因为如此，我们更要科学严谨的对待外泌体美容，了解它的原理，才能更好的应用它。

外泌体，从字面上看，就是细胞向外分泌的物体。科学释义是：细胞所分泌的直径为30~150nm的双层磷脂囊泡，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。

外泌体的作用机理

外泌体最大的功能便是人体的“通信兵”，它能在细胞间传递物质，从而调控受体细胞的功能及生物学行为。通俗的说，外泌体就好像一辆“细胞货拉拉”，装了自家一堆有用的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，进行“卸货搬家”。

希吉亚外泌体分离方法

外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，希吉亚外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、免疫磁珠法等。

Ø

超速离心法：超速离心法是大家最熟悉的一种分离方法，文献中应用最多且也是目前比较受到认可的方法。超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法耗时耗力，往往需要8-30个小时；且需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。

希吉亚外泌体美容机制

Ø

免疫磁珠法：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。

促进细胞再生。外泌体可以有效刺激受体细胞，释放细胞活力，促进其再生和新生。因而可以帮助淡化祛除斑点，促使肌肤光亮细腻。

修复受损细胞。外泌体外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成，从而让帮助修复受损的肌肤屏障。而且它可以提高受损部位的修复能力和愈合能力。

抑制炎症产生。外泌体可以诱导巨噬细胞向M2型极化，从而降低了巨噬细胞诱发炎症反应的能力，从而抑制炎症。我们肌肤的很多问题都与肌底炎症有关，而外泌体可以通过抑制炎症来让肌肤从内而外的健康起来。

干细胞疗法围绕使用完整细胞来替代丢失的组织。相反，外泌体是与细胞分离的囊泡。外泌体促进恢复青春活力的方式是利用外泌体中携带的有效成分来帮助其他细胞。

干细胞和外泌体的另一个主要区别是前者仅从身体的特定部位获得，例如：骨髓、血液、脂肪组织。而外泌体，可以从几乎所有类型的细胞中获得。胎盘中也含有大量的外泌体。

通过上述科普，大家对外泌体美容一定有了更全面的认识

非因推荐 | 肿瘤微环境研究大剖析——肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤微环境研究大剖析——肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤免疫微环境是肿瘤与宿主免疫系统之间竞争博弈的主战场，肿瘤微环境（TME）中各种细胞之间的相互作用造成免疫细胞具有依赖于TME的双重作用，并决定肿瘤相关免疫反应的结果——即免疫系统对肿瘤细胞的攻击或耐受。

肿瘤内的免疫细胞包括介导适应性免疫反应的细胞（如T细胞、B细胞等），以及介导天然免疫反应的效应细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞等），而肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 是肿瘤微环境研究中最为热门的免疫细胞亚群。越来越多的研究表明TAM具有支持肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列促进肿瘤发展的功能，与肿瘤患者的不良预后呈高度相关性。由不同巨噬细胞表型定义的亚型（M1促炎型和M2型抗炎型），与肿瘤预后的关联也有着广泛的研究，在结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌食管癌、乳腺癌、胰腺癌等癌种中，均有大量研究报道，并证实两个亚型在预后关联上的负相关性。然而如何精准的找出不同组间TAM的表达谱差异、诠释机理并结合现有的免疫疗法，实现冷热肿瘤的转换将成为抗肿瘤治疗的研究新方向。

巨噬细胞广泛分布于各种组织中。通过对不同组间巨噬细胞表达谱的对比，存在于特定组织中的巨噬细胞按其组织位置可分为肝脏中的Kupffer细胞、脑中的小胶质细胞、骨组织中的破骨细胞、肺中的肺泡巨噬细胞、肾脏中的系膜细胞和淋巴中的被膜下巨噬细胞等。不同组织中的巨噬细胞具有不同的转录和表达谱。

根据表型和功能，巨噬细胞可以分为M1(促炎，经典激活的巨噬细胞)和M2(抗炎，交替激活的巨噬细胞)两种主要类型(图1)，此外还发现其他三种巨噬细胞：肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、CD169+巨噬细胞和TCR+巨噬细胞。

截止到目前的认识，TAM具有从M1到M2样表型的特殊过渡期，这意味着它们在整个肿瘤进展过程中不仅仅属于M1或M2样表型。在肿瘤起始的早期阶段，TAM在转移到M2样型之前为M1样表型。此外，必须指出，类似巨噬细胞的M2还被进一步划分为4个子类型，即M2a、b、c和d，不同子类型的标记也不同。

M1和M2型巨噬细胞标志物分类汇总

表面分子： M2型巨噬细胞表达高水平的CD206、CD163和TGFβR，而M1型巨噬细胞表达高水平的CD40、CD80和CD86。

转录因子： STAT1和STAT3在M1表型中高度激活，STAT6在M2表型中高度激活。IRF3、5和7在M1表型中被激活，而IRF4在M2表型中被激活。

细胞因子和趋化因子： 在M1型巨噬细胞检测到TNFα、IL1β和IL12等因子的高表达，在M2型巨噬细胞检测到IL10、ALOX15和CCL18等因子的高表达。在M1型巨噬细胞当中iNOS高表达，在M2型巨噬细胞当中Arginase 1高表达。

此外，初级TAM可以通过分泌CCL2、CCL5、CCL7、CXCL8和CXCL12等趋化因子招募单核细胞，在IL4、IL6、IL10、IL13以及TGFβ刺激作用下发生极化，具有类似于M2型巨噬细胞的表型，并分泌多种细胞因子（如TGFβ、IL-10等）和趋化因子(招募Th2和调节性T细胞)，介导免疫抑制效应；分泌多种细胞因子、生长因子(如EGF、VEGF、PDGF、FGF和TGFβ）、基质金属蛋白酶(MMPs)、M-CSF等分子，促进慢性炎症、血管新生、肿瘤侵袭和调节免疫反应(图2)。在这个过程中，TAM通过分泌多种因子与肿瘤微环境多种类型细胞发生相互作用和影响，并进而介导复杂的效应(图3)。

用什么方法对肿瘤微环境当中的TAM进行分析和评估呢？

我们通过一篇发表在Cancer Microenviron的研究论文，来介绍一些基础技术。文章中分三步对非小细胞肺癌(NSCLC)患者和非肿瘤患者组织中的TAM进行分析，具体如下：

首先，此研究使用免疫组织化学(IHC)来确定与同一患者的非肿瘤组织相比，非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织当中TAM表型可能发生的表型变化。分别使用CD68（通用巨噬细胞标记）、iNOS（M1）和CD163（M2）抗体测定TAM表型。

然后，作者对不同类型NSCLC患者肿瘤组织及非肿瘤组织当中CD68、iNOS及CD163阳性染色面积占比进行了统计学分析。结果表明，与非肿瘤组织相比，在所有NSCLC亚型肿瘤组织当中CD68和M2型巨噬细胞标记CD163均明显增加(P≤0.0001)。与之相对，与非肿瘤组织相比，在肺腺癌患者和鳞状癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达降低，显著性分别为P≤0.01及P≤0.05，但大细胞癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达与非肿瘤组织相比无明显差异。

接下来，作者利用多因子液相芯片技术(Bio-plex)对不同类型NSCLC患者及正常对照血清当中介导Th1型和Th2型免疫反应相关多种细胞因子进行了检测和分析。结果表明，与正常对照相比，只有大细胞肺癌患者血清当中IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的水平增加，在其他类型的NSCLC患者当中并未发现明显变化。

非因小结

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对肿瘤的生长、转移及耐药起着重要调控作用，使得TAM成为抗肿瘤转移治疗的重要靶点。TAM功能的可塑性，使它能够通过响应于肿瘤微环境的信号分子(如细胞因子、药物)而改变自身的功能状态，因此针对TAM的深入研究具有重要的科学意义和临床价值，为肿瘤的治疗开辟新的思路和途径。

非因生物的DSP空间多组学技术可以通过对TAM的精确定位来实现不同空间组定义的巨噬细胞亚群表达谱差异的分析 （图4），从而深化科研人员对肿瘤微环境的研究。非因DSP空间多组学技术通过在单张切片上选择合适的兴趣点（Region of Interest，ROI），来实现基于每个ROI微环境的100重蛋白或＞18,000重全转录组的原位表达谱分析，是针对肿瘤免疫和肿瘤微环境设计的高精度、多维度分析的新一代空间组学技术。目前已经成功开发了针对DSP蛋白组和转录组分析的TAM研究流程，欢迎各位老师前来咨询。

（该文章部分内容转自ABclonal）

骨肉瘤免疫微环境中的巨噬细胞：对免疫治疗的影响

Front Oncol.  2020; 10: 586580.

Published online 2020 Dec 10. doi:  10.3389/fonc.2020.586580

循环单核细胞和组织驻留巨噬细胞都有助于 TAM 的积累。肿瘤细胞和基质细胞分泌的趋化因子，如 M-CSF 和CCL-2 ，可以诱导和募集单核细胞到肿瘤微环境。值得注意的是，已经发现 TAM 被骨肉瘤细胞释放的 IL-34 募集并大量浸润到骨肉瘤组织中。这些单核细胞在局部信号分子的刺激下可以分化为巨噬细胞。

与组织驻留巨噬细胞不同，活化的巨噬细胞会发展出显示不同极化状态和功能的特定表型。传统上，包括 M1 和 M2 表型的二分谱代表了巨噬细胞激活范围广泛的两个极化终端：经典激活的巨噬细胞 (M1)，受干扰素 -γ 、脂多糖 (LPS) 和 Toll 样受体 (TLR)刺激；和替代激活的巨噬细胞 (M2)，被细胞因子如 IL-4 和 IL-13 以及其他信号分子激活。

 M1 样特征的 TAM 有可能杀死肿瘤细胞并增强免疫反应。然而，在大多数肿瘤中通常表现出 M2 样免疫抑制表型的 TAM 往往会 促进血管生成 并促进血管外侵袭和免疫逃逸，最终导致肿瘤进展和转移。

①、TAMs 可以促进肿瘤血管生成。TAMs的含量与肿瘤血管的数量和密度呈正相关，分泌各种促血管生成因子，如 血管内皮生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子 (FGF) 和基质金属肽酶 9 (MMP-9)， 参与肿瘤血管生成过程。

②、TAM 还可以 通过以下方式 介导免疫抑制与各种免疫效应细胞相互作用。目前有报道称，TAMs 表达程序性死亡 1 (PD-1) 和细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4 (CTLA-4) 的配体受体，可抑制 T 细胞的活化。TAMs 不仅可以产生免疫抑制性细胞因子（ IL-10 和转化生长因子 -β （TGF-  β ） ），还可以产生 CCL5、CCL20 和 CCL22 等趋化因子，将 调节性 T 细胞 募集到肿瘤组织中。

③、TAMs 通过增加血管外渗、促进转移细胞的存活和生长以及抑制效应 T 细胞来支持肿瘤细胞的 侵袭和转移 。最终，在巨噬细胞的帮助下，在特定转移器官的远处部位建立了转移前生态位。

（略）

骨肉瘤微环境中的炎症被认为具有抗肿瘤作用。Coley's Toxins 含有热灭活的细菌或细菌产物，在 19 世纪后期被用于治疗骨肉瘤。炎症可能通过增加浸润巨噬细胞和分泌细胞因子的水平来增强抗肿瘤作用。

一项基于慢性细菌性骨髓炎小鼠模型的研究表明，感染 通过 调节巨噬细胞引发的先天免疫反应，增加了 TAM 的数量并抑制了小鼠肿瘤的生长。此外，巨噬细胞的消耗逆转了这些抗肿瘤反应。此外，感染上调炎性巨噬细胞的细胞因子分泌，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素 -γ （IFN-  γ ），并重新激活免疫系统对抗肿瘤反应以减轻骨肉瘤诱导的免疫抑制。虽然这些模型不能精确模拟骨肉瘤的局部炎症微环境，但这些临床前研究与上述临床数据一起，为巨噬细胞在骨肉瘤中的作用和炎症反应提供了新的认识。

首先，TAM 可以通过分泌细胞因子、生长因子和外泌体来维持细胞存活 。这些因素可能有助于激活抗凋亡程序和调节 CSC 活动。还发现巨噬细胞通过表达组织蛋白酶 B 和 S 部分地保护免受紫杉醇诱导的肿瘤细胞死亡。

其次，巨噬细胞诱导的免疫抑制也与肿瘤的化疗耐受性有关。德纳多等人。发现 CSF1R 拮抗剂 对巨噬细胞的抑制通过 CD8 + T 细胞依赖性机制提高了荷乳腺肿瘤小鼠对紫杉醇的存活率。此外，Ruffell 等人。证实 M2 型巨噬细胞分泌的 IL-10 抑制树突细胞表达 IL-12 ，从而 阻断 CD8 + T 细胞的反应 。

第三，巨噬细胞也可能影响血管化，间接调节肿瘤对化疗的敏感性。巨噬细胞中 VEGF-A 的清除导致血管生长正常化，并增强了肺癌肿瘤对环磷酰胺和顺铂等细胞毒性药物的敏感性 。

新辅助化疗反应不佳的骨肉瘤患者的肿瘤组织中浸润的 CD68 +细胞较高。此外，在化疗药物治疗后，巨噬细胞分泌IL-1β，可激活下游癌症信号通路，降低骨肉瘤对化疗药物的敏感性。

 M2 型 TAM 分泌的 CCL18 促进骨肉瘤的增殖和转移,这些效应归因于 lncRNA UCA1/Wnt/β-catenin 通路的上调。M2 巨噬细胞通过分泌基质金属蛋白酶 12（MMP-12）促进骨肉瘤的转移，基质金属蛋白酶 12 已被公认为转移相关因子并参与降解细胞外基质。TAMs促进骨肉瘤细胞环氧化酶2（COX-2）的表达，激活COX-2/STAT3轴和上皮间质转化（EMT），促进骨肉瘤侵袭和肺转移。

人类骨肉瘤细胞产生的趋化因子配体 5 (CCL5) 的增加促进了巨噬细胞的募集。骨肉瘤表达的单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1，也称 CCL2 ） 通过以下途径 参与巨噬细胞募集和浸润的调控MCP-1/CCR2 轴。

 M2 巨噬细胞相关细胞因子，如 IL10 和转化生长因子-β2 (TGFB2) ，并将巨噬细胞调节为促肿瘤 M2 表型。

CD47 被认为是一种“不要吃我”的信号，它与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α (SIRP α )结合，导致吞噬作用逃逸和细胞死亡 

Mifamurtide     激活巨噬细胞和单核细胞，增强杀瘤活性，抑制肿瘤生长和转移。可溶性细胞因子如 TNF-α 和 IL1-β 的诱导在 L-MTP-PE 对巨噬细胞的作用机制中起作用。

许多因素将 TAM 重新极化为 M1 样表型，例如 IFN-γ、IL-12，导致 STAT 信号通路的激活 。TLR 是抗原呈递细胞（包括巨噬细胞）表达的重要病原体识别受体。的TLR激动剂诱导M2转化为M1表型引发抗肿瘤作用。除了细胞因子和 TLR 激动剂外，还使用 抗 CSF1 和抗 CD40 等抗体来改变 TAM 极化

吉非替尼是一种表皮生长因子受体 (EGFR) 抑制剂， 通过 抑制巨噬细胞受体相互作用蛋白激酶 2 (RIPK2)改变肺巨噬细胞表型以阻止骨肉瘤侵袭并减少转移负担。

巨噬细胞极化中的作用

噬细胞极化的概念和分类

巨噬细胞是一类先天免疫细胞，具有趋化、吞噬、调节炎症反应和杀灭微生物的作用，是机体非特异性免疫的重要组成部分。巨噬细胞还能摄取、处理抗原并提呈给T细胞识别，参与特异性免疫应答。近年来人们研究发现，巨噬细胞可以根据微环境的变化而改变其表型，从而具有多样的功能，即为巨噬细胞极化，也被称为巨噬细胞的表型转换或巨噬细胞重编码。尽管微环境变化所产生的巨噬细胞的功能表型是多样的，但是两种主要的巨噬细胞表型，即经典激活的巨噬细胞（M1）和选择性激活的巨噬细胞（M2），它们代表了巨噬细胞极化的两个极端。

（二）巨噬细胞极化的特征和功能

M1型巨噬细胞可由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）单独或与其他细胞因子［如干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor α，TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）］协同诱导活化。它的特征是分泌大量炎症因子［白介素（interleukin，IL）12、IL-1β、IL-6、IL-23和TNF-α］，产生诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）依赖的活性氧中间体（reactive oxygen intermediates，ROI）和活性氮中间体（reactive nitrogen intermediates，RNI），并增强抗原提呈能力。它是宿主消灭病原体的主要效应细胞，但是持续的M1活化及其反应产物生成也可导致组织损伤。

M2型巨噬细胞可由IL-4、IL-13、IL-10、转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、糖皮质激素、免疫复合物等诱导活化。它的特征是表达细胞标志物如精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、类几丁质酶3（chitinase3，Chil3，也称Ym1）、类抵抗素α（resistin-like-α，Relmα，也称Fizz1）、甘露糖受体（mannose receptor，MRC1，也称CD206）和抗炎因子IL-10。M2型巨噬细胞具有抗炎、血管生成和组织修复等功能。

当然，巨噬细胞的激活不单

什么是肿瘤相关巨噬细胞

简称TAM,一般认为，在肿瘤为环境中，巨噬细胞被异常极化，此时，其分泌的细胞因子以IL10升高，而IL12降低为主要表现。使得免疫细胞的功能收到抑制，一般认为这种存在于肿瘤微环境中的巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。