外泌体分析鉴定公司（外泌体的分离与鉴定）

本文目录一览：

• 1、思路迪诊断NGS的检测流程是什么？
• 2、AI+合成+医疗企业近期动态盘点
• 3、求教有了解思路迪诊断外泌体蛋白辅助诊断早期卵巢癌项目的吗？简单介绍下
• 4、New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles
• 5、如何对exosomes进行成分分析
• 6、瑞芯智造高分辨率纳米单颗粒分析仪怎么样？

思路迪诊断NGS的检测流程是什么？

现在随着全球科学技术的发展，抗肿瘤领域的治疗更加的多元化。比如精准医疗方面，如今NGS（二代测序）已经成为抗肿瘤治疗路上不可或缺的辅助诊断工具。流程如下：

对于接受NGS检测的患者来说，只需要提供组织标本以及无创ctDNA标本，NGS的检测流程非常严格，从样本接收到最终生成报告，思路迪其实需要经历10个流程：接收样本、查病理核查、溶血分离、核酸抽提、文库构建、自动化捕获过程、测序、分析加注释、复核发报告。

在经历严格的复核环节之后，最终的报告就以严谨、可信的姿态呈现到医生和病人的面前了，得出的结果可以为临床医师后续肿瘤治疗的策略提供参考。

官方信息显示，思路迪诊断自思路迪集团分拆而来，专注于精准诊断，目前拥有包括NGS（基因二代测序技术）、qPCR、外泌体核酸/蛋白检测和人工智能数据分析等技术平台，还拥有多家第三方检验所，旗下研发人员超过200名。

目前，思路迪诊断拥有第三方医学检验服务以及IVD设备和试剂两大业务线，布局了包括肿瘤（从早期诊断、伴随诊断到动态监测）和微生物诊断领域的一系列产品研发管线。

其中在肿瘤早期诊断领域，思路迪诊断基于自主的外泌体标志物开发平台，研发出的卵巢癌早期诊断试剂盒已经进入注册临床试验。

另外，在肿瘤伴随诊断和动态监测领域，思路迪在2018年完成了全自动化数据分析系统。紧接着在2019年，旗下研发的具备全自动化封闭式基因文库制备功能的ANDiS400获得中国药监局上市许可。

目前思路迪诊断已经形成了一系列全自动化平台研发管线，并建立了相应的伴随诊断和动态监测自动化产品开发注册管线。未来随着该管线产品的陆续上市，有助于突破肿瘤NGS技术因为过于复杂而无法规模化在国内医院落地的瓶颈。

AI+合成+医疗企业近期动态盘点

「沃时 科技 」致力于搭建AI制药工业平台

以构建制药工业场景AI决策平台为目标的「沃时 科技 」，近日宣布完成千万元天使轮融资，投资方为线性资本，由前一轮股东继续追加投资。

沃时 科技 表示，下一步目标是搭建AI自动化合成平台，结合利用硬件集成与软件的精细控制，实现在合成自动化领域的突破，进而赋能研发人员使其在更具创造性的领域发挥优势。目前已经与客户洽谈合作，预计明年就会推出原型机。

「Deep Genomics」完成1.8亿美元的C轮融资

近日，AI 驱动的RNA疗法开发公司Deep Genomics宣布完成1.8亿美元的C轮融资。所获资金将用于推动Deep Genomics AI平台的建设和RNA疗法管线的开发。

Deep Genomics已经构建了一套称为AI Workbench的系统，该系统已经对整个人类基因组、数百万种遗传变异和数亿种新化合物进行了数十亿次预测。目前AI Workbench已迭代到3.0版本，支持更常见的复杂疾病的靶点识别和药物发现，疾病领域覆盖神经发育、神经退行性和代谢疾病。

「T-knife」：让TCR-T细胞疗法走向临床

近日，过继性T细胞治疗公司T-knife Therapeutics筹集了1.1亿美元的B轮融资，用于开发下一代完全个性化的新生抗原T细胞受体（TCR）疗法。

T-knife公司通过共同创始人Thomas Blankenstein教授的开拓性工作建立了其携带整个人类TCRαβ基因位点的专有HuTCR转基因小鼠平台，该小鼠平台仅表达限于人类HLA的人类TCR。同时相关研究还表明，用人类肿瘤抗原免疫HuTCR小鼠鉴定具有优化亲和力/特异性特征的TCR的CD4+和CD8+T细胞，能够显著提升细胞的抗肿瘤活性。T-knife在随后的工作中通过有效的基因启动和TCR选择建立了非常多样化的TCR库。并利用这种天然的高亲和力TCR选择平台为临床开发开发了一系列获得专利的独特TCR候选药物。

「中慧元通」获超6亿元Pre-IPO轮融资

中慧元通获超6亿元Pre-IPO轮融资，投资方有盈科资本、弘晖资本、国海创新资本、松禾资本等。

中慧元通是一家从事疫苗研发、注册申报、产业化和销售的专业公司。目前该公司已取得儿童型四价流感病毒亚单位疫苗、成人型四价流感病毒亚单位疫苗、重组带状疱疹疫苗、九价重组人乳头瘤病毒疫苗4个一类新药临床批件、23价肺炎球菌多糖疫苗1个九类新药临床批件。

「金迪克生物」在上海证券交易所科创板上市

8月2日，金迪克生物正式在上海证券交易所科创板上市。根据金迪克生物招股说明书，该公司本次IPO的保荐机构为中信证券，发行价格为55.18元/股，募集资金总额约16亿元人民币。金迪克生物成立于2008年，一直以来专注于人用疫苗研发、生产、销售。

「博动医学」专注血管介入诊疗

博动医学影像 科技 （上海）有限公司（博动医学）宣布完成超亿美元C轮融资。本轮融资资金将用于公司产品的商业化加速、新产品研发、临床注册，进一步完善血管介入诊疗的全球化布局。

博动医学2015年9月成立于上海，由行业资深管理团队和全球顶尖科学家共同创办，致力于成为全球血管介入诊疗的行业领导者。公司产品覆盖血管疾病精准筛查、术中诊断与手术规划、术后疗效评估与患者风险预判等完整血管介入诊疗产业链。截止目前，博动医学拥有70余项中美德日等国专利，具备诸多全球首创顶尖技术。

「恩泽康泰」外泌体+医疗服务

近日，北京恩泽康泰生物 科技 有限公司（恩泽康泰）宣布完成近亿元的A轮融资。融资所得将主要用于公司外泌体治疗中试车间的建设、临床前系列产品研发以及外泌体工程化改造技术平台搭建。

恩泽康泰成立于2017年，该公司是国内首家致力于外泌体技术开发与临床转化的创新型高 科技 企业，旗下业务板块主要分为：其一，是基于外泌体的创新药研发，主要涵盖肿瘤免疫、罕见病及神经系统疾病等领域；其二，以外泌体为基础的转化医学研究服务，主要与临床专家合作展开科学研究，目前业务已经覆盖全国主要重点城市，已经与国内50多家知名三甲医院和科研单位以及多家精准医学企业建立合作。

「星奕昂生物」开发NK新技术平台和产品

近日，星奕昂生物 科技 有限公司（Neukio Biotherapeutics）宣布完成了4000万美元的天使轮融资。本轮资金将主要用于研发设施建设和通用型现货免疫细胞技术平台和产品的早期开发。

星奕昂创始人，董事长兼首席执行官王立群博士在美国和中国的生物制药领域拥有丰富的专业技术和研发管理经验，曾任复星医药和美国凯特合资公司复星凯特的创始总裁。王立群博士表示：「星奕昂从上海自贸壹号生命科学园区再启程，正在组建核心团队，有信心在通用型细胞治疗领域做出0到1的创新。公司天使轮融资便获得多个著名创新药投资机构的青睐，非常感谢礼来亚洲基金、IDG资本和夏尔巴投资对我们核心团队的能力和技术创新理念的认可和支持。」

「大橡 科技 」类器官芯片领跑者

北京大橡 科技 有限公司（大橡 科技 ）近日宣布获得数千万A+轮融资资金支持。大橡 科技 被称为是国内类器官芯片（Organoid-on-a-Chip）领域的先行者。CEO周宇透露，此次融资，除用于加速器官芯片产业链布局外，更将着重推进类器官芯片技术迭代，针对癌症、神经退行性疾病、炎症性疾病等领域的创新药物研发提供高仿生、高通量的模型，同时完善类器官标准化培养体系及在个性化精准医疗领域的应用。

「Ring」专注于基因治疗

近日，Ring Therapeutics完成了1.17亿美元的B轮融资，接下来将通过引入一种全新的基因治疗载体平台来正面应对基因治疗领域的各类挑战。

Ring利用共生病毒组创造了Anellovectors这种由单链DNA环组成的工程载体，一旦使用，将作为附加体保留在细胞核中。这些工程化的指环病毒载体能够将DNA转移到新细胞中，同时不会损害 健康 组织或激活患者的免疫系统。因此，如果有免疫障碍或复发的患者需要再次给药，患者也完全可以进行重复给药，不存在一次性给药的缺陷。

Ring自2017年创立以来，就在着手研究哪些病毒不会引起疾病，从而确定哪些病毒存在于人类体内和人类之间。该公司已经发现了数千种基于指环病毒的候选载体，并有可能在各种疾病中实现基因疗法和核酸药物。此次1.17亿的B轮融资将帮助Ring扩展其载体平台，继续建立其制造能力，以生产用于临床前测试的载体库，并为一项研究提供资金，使公司尽快进入临床。

求教有了解思路迪诊断外泌体蛋白辅助诊断早期卵巢癌项目的吗？简单介绍下

这个项目是由思路迪诊断开发团队历经多年研究出来的成果，将高效的外泌体提取方法与高敏的化学发光免疫分析法相结合，开创性地开发出了外泌体卵巢癌辅助诊断试剂盒，并且在全自动化学发光平台上建立起了一个基于三指标检测结果的自动分析模型OCS，可直接对检测结果进行分析，进而提示受试者卵巢附件包块的恶性风险。

并且，作为优秀的高新企业代表，上海思路迪生物医学科技有限公司不负众望，“外泌体蛋白辅助诊断早期卵巢癌”项目成功入围全国颠覆性技术创新大赛领域赛，这个项目不仅再度彰显了思路迪诊断技术上的雄厚实力，也为临床医生在发现、诊断卵巢癌时，提供了更精准、更便捷的应用辅助。

New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles

原文链接： Huilin Shao, Hyungsoon Im, Cesar M. Castro, Xandra Breakefield, Ralph Weissleder and Hakho Lee. New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles. Chem Rev. 2018 Feb 28;118(4):1917-1950. doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00534.

该综述发表在Chemical Reviews杂志上，影响因子高达54.301分，对细胞外囊泡的研究方法总结非常全面，基本上目前EVs研究中用到的研究方法，这篇综述都有介绍，十分详尽！通讯作者是哈佛大学的Hakho Lee教授。

Extracellular Vesicles (EVs) 细胞外囊泡是由细胞主动释放的多样的纳米级膜囊泡。类似大小的囊泡可根据其生物发生、大小和生物物理性质进一步分类(如外泌体、微囊泡)。虽然EVs最初被认为是细胞碎片，因此未被重视，但现在EVs越来越多地被认为是细胞间通信和疾病诊断和预后的循环生物标志物的重要载体。

该综述的内容包含：

生物流体（Biofluids）中含有大量的EVs，这些EVs可以从Parental Cells转移不同的分子去其他细胞，包括：蛋白，mRNA/miRNA，DNA等。

EV的形成决定了其膜组成。

微小囊泡的膜组成最能反映其Parental Cells(母细胞)的质膜。

相反，外泌体中已经鉴定出特异性的内体蛋白分子，这反映出外泌体形成的机制。内体分选复合物（ESCRT）已被广泛认为用于调节和引导特定分子进入MVB的腔内囊泡。ESCRT及其四个主要复合物（ESCRT 0，I，II和III）负责传递泛素化蛋白，用于溶酶体降解和蛋白回收。最近的研究表明，特定的ESCRT家族蛋白的耗竭可以改变外泌体的蛋白质含量和细胞释放外泌体的速率。更有趣的是，发现外泌体富含ESCRT系统的成分（例如TSG101和Alix），可用作外泌体识别的标记。

ESCRT不是介导外泌体形成的唯一机制。其他不依赖ESCRT的过程似乎也能以相互交织的方式参与其形成和分泌。外泌体也富含ESCRT非依赖性的分子。例如，四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81已被证明参与内体小泡运输。小GTP酶的Rab家族参与小泡运输和与质膜融合表明这些蛋白在释放外泌体中的作用。另外，外泌体中神经酰胺水平升高，抑制鞘磷脂会引起的外泌体释放减少，表明鞘磷脂酶与囊泡释放有关。

外泌体和微囊泡都包含核酸，包括miRNA，mRNA，DNA和其他非编码RNA。自从最初发现EV含有RNA，人们一直非常关注EV RNA用作诊断生物标志物。在开创性的工作中，Skog等人发现胶质母细胞瘤患者的血清外泌体含有特征性的突变mRNA（EGFRvIII mRNA）和miRNA，可用于提供诊断信息。这些核酸的发现导致了这样的假设，即EVs可以在细胞之间转移遗传信息。确实，瓦拉迪等人和Skog等表明，EV含有转移进入宿主细胞后仍然可以翻译的mRNA。EV中也有逆转座子和其他非编码RNA的表达。逆转录转座子序列和miRNA以及可翻译的mRNA都通过EV进行转移，这些成果突出了EVs作为遗传信息的载体和传播者的重要性。

虽然传统的光学显微镜的衍射极限接近EV的大小，但是不能产生清晰的图像。高分辨率EV图像需要通过电子显微镜(EM)或原子力显微镜(AFM)得到。然而，这些方法的通量有限，因为需要专门的染色方案和设备。

（a）扫描电子显微镜（SEM）提供三维的表面拓扑信息。

（b）透射电子显微镜（TEM）具有出色的图像分辨率，可结合免疫金标记一起使用来提供分子表征。

（c）冷冻电镜（cryo-EM）无需大量处理即可分析EV形态。

动态光散射 (DLS)，也称作 光子相关光谱 或 准弹性光散射 ，是一种物理表征手段，用来测量 溶液 或 悬浮液 中的 粒径分布 ，也可以用来测量如高分子浓溶液等复杂 流体 的行为。当光射到远小于其波长的小颗粒上时，光会向各方向散射（ 瑞利散射 ）。如果光源是 激光 ，在某一方向上，我们可以观察到散射光的强度随时间而波动，这是因为溶液中的微小颗粒在做 布朗运动 ，且每个发生散射的颗粒之间的距离一直随时间变化。来自不同颗粒的散射光因相位不同产生建设性或破坏性干涉。所得到的强度随时间波动的曲线带有引起散射的颗粒随时间移动的资讯。动态光散射实验易受灰尘或杂质影响，故样品的 过滤 和 离心 十分重要。

动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。

动态光散射是收集溶液中做布朗运动的颗粒散射光强度起伏的变化，通过相关器将光强的波动转化为相关曲线，从而得到光强波动的速度，计算出粒子的扩散速度信息和粒子的粒径。 小颗粒样品的布朗运动速度快，光强波动较快，相关曲线衰减较快，大颗粒反之。

在外泌体研究中，动态光散射测量敏感度较高，测量下限为10纳米。相对于SEM技术来说，样品制备简单，只需要简单的过滤，测量速度较快。但是动态光散射技术由于是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。

纳米粒子跟踪分析(NTA) 是一种光学粒子跟踪方法，用于确定粒子的浓度和大小分布。用光束照射样品中的粒子。当粒子散射光并经历布朗运动时，摄像机记录下每个粒子的路径以确定平均速度和扩散率。与DLS的体散射测量不同，NTA跟踪单个粒子的散射。

然后，此信息将用于数学计算浓度（即视野中的粒子数量）和尺寸分布（即通过Strokes-Einstein方程的流体动力学直径，图5b）。 为了准确定量异质囊泡的浓度和大小，NTA程序需要精确优化摄像头和分析设置。 可能需要使用不同设置进行单独测量，以获取异质混合物中EV子集的准确读数。

EVs在大小、起源和分子组成上都是异质性的；除此之外，它们还存在于不同的复杂的生物流体中，包括血、胸腔积液、腹水、乳汁、唾液、脑脊液和尿液。这些流体中还含有大量的非囊泡大分子结构，可能会干扰EV的分析。所以EV的分离和富集显得尤为重要。

超速离心法（80%）和密度梯度离心法（20%）是最常见的两种高通量混合分离法。根据它们分离机制，这些方法可以分为三大类:密度、亲和和大小。

用不同的离心力将颗粒分离:以较低的离心力(300g)去除细胞碎片，而以较高的离心力(100000g)对EV进行沉淀和浓缩。尽管该方法是应用最广泛的金标准，但它也有许多缺点，如体积大、仪器昂贵、处理时间长、过程繁琐、被聚集的蛋白质和核蛋白颗粒污染以及需要大量的样品。

蔗糖梯度离心法是一种更为严格的超速离心法，它有助于进一步分离不同密度的囊泡，通常用于分离外泌体(悬浮密度为1.15至1.19 g/mL)。在这种方法中，一个包含不同大小囊泡和大分子的样品在一个密度从上到下递增的梯度表面上被分层。在离心过程中，不同的分子以不同的速率通过梯度沉积。由于其分辨率更高，该方法被认为可以分离更高纯度的EVs(特别是外泌体)；然而，它面临着许多与超速离心法相关的限制。更加新的等渗梯度(如碘黄醇梯度)法被认为效果更好。

最近，基于聚合物共沉淀法的商业试剂盒(例如，ExoQuick, Exo-Spin)已被开发用于EV富集。这些试剂采用降低EV的水合作用(从而降低溶解度)导致沉淀，然后在低离心力的情况下，沉淀的EV产物可以很容易地、重复性地分离出来，从而避免了长时间的超速离心法操作。然而，这些试剂盒对于大规模使用来说是昂贵的，而且对于EV来说缺乏特异性。该方法还容易产生非均相聚合物颗粒。由于这些试剂均降低了EV和蛋白质的溶解度，因此该方法还可共沉淀脂蛋白和Ago-2 RNA复合物。因此，共沉淀法作为EV分离方法受到了限制。

大小排阻色谱法根据它们的分子大小通过凝胶过滤来分离囊泡和其他分子。这种凝胶由含有特定大小分布孔隙的球形珠组成。当样品进入凝胶时，小分子扩散到孔隙中，而大分子则直接洗脱。因此，大分子比小分子更早地离开色谱柱，这使得分子的停留时间与色谱柱的大小相关联成为可能。近年来，该分离方法已被应用于从复杂的生物媒介中分离纯化囊泡。Sepharose, GE Healthcare; qEV, iZon等商业公司也正在开发商业的产品以简化EV富集，这些产品的排除柱都大约是75纳米孔径的树脂。蛋白质和其他较小的污染分子被滞留在孔径中，而较大的囊泡(75 nm)可以迅速通过并在空隙中被洗脱。大小排阻法可将EV与可溶性蛋白分离；为提高分离的效率和分辨率，需要考虑多种因素，包括介质类型、孔径、EV与介质之间的相互作用、柱的尺寸、柱的填充以及流速等。

为了提高复杂生物流体的EV分离效率和特异性，人们开发了多种新的EV富集方法。然而，与传统方法相比，这些新方法中的大多数具有较低的吞吐率，应加以解决使之变得实用。

基于分子大小的分离是一种很有潜力的方法，可以将EV与大型细胞碎片分离开来。各种微流体过滤系统已经被开发出来，用于从大的细胞碎片和蛋白质聚集物中分离EV，这些系统大部分是基于分子大小差异。例如,Rho等人构建了一种微流控设备，该设备使用膜过滤器对未处理的血液样本进行筛选，来分离EV。膜过滤器的大小∼1μm。在膜的下方插入一个毛细管，用于引导过滤后的EV进入收集通道。膜过滤器和毛细管导向器夹在两个环形磁铁之间；这种设置在进行大量的样品处理时可以方便地更换过滤器集。

Lee等人最近使用声波以无接触方式对EV进行细分。这种分离利用超声波驻波，根据囊泡的大小和密度对其施加不同的声交互作用力。该装置由一对相互交错的换能器(IDT)电极组成，用以产生跨流动通道的驻波表面声波。

EV蛋白主要来源于胞质膜、胞质醇，而非其他胞内细胞器(如高尔基体、内质网、细胞核等)。EV蛋白质的构成提示了囊泡的生物发生和cargo sorting(这个翻译有点怪)。因此国际细胞外囊泡组织建议应该仔细鉴定EV蛋白，特别是跨膜蛋白和胞质蛋白。

在哺乳动物中，跨膜蛋白和脂质结合的细胞外蛋白(如内贴蛋白)都与微囊泡和外泌体有关。外泌体的跨膜蛋白富含四聚体蛋白(如CD9、CD63和CD81)一个具有四个跨膜结构域的蛋白质超家族。四聚体蛋白参与细胞膜的转运和生物合成的成熟，在外泌体中高表达，这一特性使得四聚体蛋白被用于外泌体的定量和表征。然而，需要注意的是，四聚体蛋白并不只在外泌体中唯一表达。另一方面，微囊泡富含整合素、选择素和CD40配体，表明它们来自于细胞的质膜，EV富含特异的跨膜蛋白受体(如表皮生长因子受体/ EGFRs)和黏附蛋白(如上皮细胞黏附分子/EpCAM)。由于许多跨膜蛋白参与了正常生理和疾病的发病机制，它们被用作重要的病理生理学EV生物标志物。

EV相关的囊内蛋白具有多种功能。它们包括具有膜或受体结合能力的参与囊泡运输的胞质蛋白，如TSG101、ALIX、annexin和Rabs。EV还富含细胞骨架蛋白(如:内酯、肌凝蛋白和小管蛋白)、分子伴侣蛋白(如:热休克蛋白/HSPs)、代谢酶(如:烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶/GAPDH和核糖体蛋白)。有趣的是，最近的研究发现EV蛋白可以被受体细胞有效地运输和接收，从而在体内和体外引起强烈的细胞反应。这带来了EV作为治疗和药物载体的新机遇。

EV蛋白的定量和特征鉴定不仅对阐明EV的生物发生和cargo sorting有重要意义，而且对鉴别生理和病理标志物也有重要意义。然而，传统的蛋白质分析，包括Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)，通常需要大样本量、大量处理和/或庞大的专门仪器，因而不太适合临床应用。

在EV蛋白评估时，Western blotting可能是最常用的技术，用于提示与EV相关的靶蛋白的存在。在这个过程中，纯化的囊泡制剂(通常通过现行的梯度超离心法金标准制备)可以用含有变性剂和蛋白酶抑制剂的缓冲裂解液进行处理。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS−PAGE)分离蛋白裂解物，然后转移到膜上，对特定的蛋白target进行免疫印迹。虽然这种方法有很长的准备和处理时间( 10h)，但是Western blotting可以提供关于蛋白质分子大小的有用信息。

不像Western blotting，ELISA只能在相对较小的范围内对目标蛋白进行定量，质谱分析可实现高通量肽谱分析。纯化的EV制剂经过酶消化和肽分离，然后用质谱仪电离分析。在这个复杂的过程中，多个步骤严重影响EV蛋白组学分析。除了有效的EV纯化，质谱分析之前的肽分馏被认为是鉴定囊泡蛋白的一个重要前提。通常通过三种主要方法实现：(1)SDS−PAGE，(2)二维液相色谱和(3)基于等电聚焦的分馏。

值得注意的是，既然质谱分析可以鉴定消化后的肽片段，那么适当的蛋白质鉴定、定量和验证是必要的。已经有两种用于定量的技术方法：基于标签的和无标签的。在基于标签的定量分析中，标签(等压或同位素)被用于比较分析。无标签的定量分析中，色谱强度的谱计数被应用。识别出的候选蛋白可以使用其他传统的蛋白质技术如Western blotting进行验证。在检测灵敏度方面，质谱法通常不如基于抗体的技术敏感。

虽然质谱分析需要大量的准备和处理时间(数天)，但它可以提供高通量、定量和EV比较蛋白质组分析。到目前为止，已有成千上万的囊泡蛋白被系统分类，蛋白质-蛋白质相互作用分析。基于质谱的哺乳动物和细菌EV的蛋白质组学分析的详细讨论已经在一些综述中被强调。这些网络和相互作用的研究有助于阐明EV载体的功能活动及其在细胞间远距离通信中的重要作用。

为了解决EV蛋白质定量相关的技术挑战，新一代生物传感器正在开发中。与传统的蛋白质检测方法相比，这些生物传感器利用独特的传感机制，可以检测各种大小和分子含量的EV。这些技术中的许多只需要更小的样本量和更少的样本处理过程，因此非常适合于医疗应用。

流式细胞术是一种基于光散射和荧光激活来分选单个大颗粒(如细胞或微米大小的实体)的强大的技术，然而，传统的流式细胞术对检测直径小于500 nm的小颗粒的灵敏度和分辨率有限。此外，它还受到高光学背景的影响，由于鞘层流体中存在小颗粒(约200 nm)。用传统流式细胞术量化EV时，大量的小EV可能被忽略或者计数偏低：可能同时有多个小的囊泡被照亮被计数成一个单独的事件，这种现象被称为“群体理论”。

为了解决传统流式细胞术的弊端，微米大小的乳胶珠被用来绑定多个囊泡。然后用荧光抗体对结合的EV进行染色，并对其蛋白标记物进行鉴定。然而，这种方法缺乏分析单个囊泡的能力，并且不能区分不同的囊泡亚群，这可能会导致特征的丢失。

该技术主要基于磁性纳米粒子(MNPs)。由于大多数生物物质天然缺乏铁磁背景，这种传感几乎不受同系统中其他生物样品的干扰。因此，即使光学上浑浊的样品对磁场也是透明的；当靶分子被特定的MNPs靶向时，它们与自然的生物背景形成了强烈的对比。在基于核磁共振(NMR)的磁检测中，MNPs置于NMR磁场中，产生局部磁场，改变周围水分子的横向弛豫率，放大分析信号。因此，核磁共振减少了样本处理过程，提高了检测灵敏度，已经被开发用于多个医疗点应用(例如，直接从血液样本中检测循环肿瘤细胞和细菌)。

但是将这种技术运用在EV检测上却遇到了挑战，因为EV明显比肿瘤细胞小1到2个数量级。Shao等人开发了一种专门用于EV检测和蛋白质分析的新分析技术。此方法采用两步生物正交点击化学方法来标记EV，这种小分子(200 Da)标记策略并没有显著增加抗体或MNP的大小，从而提高了从非结合抗体和MNPs中保留目标囊泡的效率。使用微流控芯片上微核磁共振(μNMR)直接测量EV来确定EV生物标志物的丰度。

相比传统的蛋白技术，μNMR系统表现出更好的检测灵敏度：比WB和ELASA灵敏10 3 倍。Shao等人利用这种集成技术可研究在培养皿中生长的多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞系中的EV。比较蛋白分析证实，EV确实反映了其亲代细胞的蛋白概况，组合GBM的四种标志物(EGFR、EGFRvIII、PDPN和IDH1)

R132H)可用于区分癌症来源的EVs与宿主细胞来源的EVs。

鉴于EV的尺寸小，一种新的快速无标签EVs检测方案：表面等离子体共振(SPR)被提出。SPR是指在入射光照射下，金属介电界面上传导电子的集体振荡。不同于其他基于时敏荧光和化学发光探针的光学检测方法，SPR传感检测金属-介电介面附近生物分子结合相关的局部折射率变化，应用于无标签和实时检测。

RNA是EV携带的主要核酸。与细胞中的RNA相比，eEV运输的RNA通常更短(通常200个核苷酸，但也有长达5 kb的)。它们主要是非编码rna，包括microRNA(miRNA)、tRNA (tRNA)、长链非编码RNA (lnRNA)和片段化的mRNA。编码mRNA (mRNA)已在长度为200~1000个核苷酸的转录组中被识别。mRNA可以翻译成蛋白质，而miRNA可以调节受体细胞中靶mRNA的翻译。EV中RNA的数量和性质可以根据其来源的细胞类型而变化。

由于它们在受体细胞中保留了功能，研究人员提出了有趣的假设，即可能存在专门的机制将不同的RNA分配给EV运输到特定的受体细胞，或可能利用这些机制运送治疗性RNA到特定的部位。这是一个活跃的研究领域，已经有一些综述对其进行阐述。

近年来的研究发现，EV中含有相当比例的母细胞的mRNA，其中许多是细胞特异性的mRNA。这些mRNA分子通常以片段的形式存在于EV中，保护其不被RNA酶降解，使它们成为强有力的循环生物标志物。

此外，已在多个研究中得到证实：EV中一些2 kb的mRNA分子能够编码支持蛋白质合成的多肽(即，蛋白质翻译的功能)。这些研究强调了EV作为特定的细胞信使在影响受体细胞和促进细胞间通讯等多方面的作用。

miRNA是一类小的非编码rna(一般为17 - 24个核苷酸)，通常通过靶向mRNA的3’非翻译区介导转录后基因沉默。通过抑制蛋白质的翻译，EV miRNAs在许多生物过程中都是强有力的调控因子。不同于EV中的循环mRNA，miRNA可以以多种稳定形式存在于体液中。除了被包裹在EV中，循环miRNA还可以被加载到高密度脂蛋白或结合到囊泡外的AGO2蛋白上。目前的证据表明，虽然大多数循环miRNA都与RNA结合蛋白相结合，但在EV中也能发现少量的miRNA。然而，miRNAs在EV中的分布仍不清楚。与mRNA的情况一样，EVs中的miRNA表达反映了其细胞来源，但与亲代细胞略有不同。一些miRNA已被发现优先表达在EV中，并在受体细胞中保持功能以调节蛋白翻译。最近的研究还发现，在哺乳动物细胞培养中常用的胎牛血清可能在体外EV制备过程中导致miRNA伪影。

通过NGS，我们还发现有其他类型的RNA存在EV中。这些RNA包括tRNA，rRNA，小核RNA(snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)以及长链非编码RNA (lncRNA)。参见上表。

最近的研究表明某些EV可能含有DNA片段。这些DNA是双链片段，范围从100个碱基对(bp)到2.5 k bp，EV外部还有一些与之相关的2.5k bp的DNA片段。这些片段代表整个基因组DNA，可用于鉴定亲代肿瘤细胞中存在的突变。虽然有可信的证据表明在EV中存在DNA，但其功能尚未确定。

EV核酸作为一种潜在的循环生物标志物和受体细胞间的调节因子已被广泛研究。传统的核酸提取和分析工具已经成功地为我们理解EV核酸奠定了重要的基础。由于EVs中核酸的含量较低，开发高效的提取方法和灵敏的检测策略是非常重要的，特别是在小样本中对稀有目标分子进行检测。

随着人们对利用EV核酸作为微创诊断标记的兴趣日益浓厚，新的生物传感器技术已被开发出来，使提取和分析变得更加高效、快速。这些新平台中有许多提供了对目标核酸标记的敏感定量，并且能够在复杂的生物学背景下识别疾病标记，甚至包括单核苷酸点突变。这为个性化临床医疗开辟了许多新的机会。

虽然传统PCR是检测基因/转录突变的强大技术(例如，EGFRvIII缺失突变)，但其敏感性有限，其在检测单核苷酸突变方面存在很多不足。这个问题与EVs特别相关，因为在野生型转录本的大背景中，突变转录本的比例很低。Chen等人最近采用了一种液滴数字PCR (ddPCR)技术来检测EV中的罕见突变。

Shao等人最近开发了一种综合微流控平台，用于现场EV核酸分析，该平台集成了三个功能模块：靶向富集EVs，芯片上RNA分离，实时RNA分析。这个平台被称为免疫磁性外泌体RNA(iMER)分析平台：利用抗体功能化的磁珠从宿主来源的囊泡中分离癌症特异性EVs，然后在芯片上裂解免疫磁珠吸附的囊泡。当EV裂解液通过玻璃珠过滤器时，选择性吸附EV RNA并从过滤器中洗脱，用于反转录和qPCR分析。为了简化分析过程，所有关键部件都集成到一个芯片盒中。

随着该系统的发展，作者研究了核蛋白的两个mRNA靶标，MGMT(6-甲基鸟嘌呤)

肿瘤是一种复杂的结构，包括恶性细胞和周围的基质细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞。最近的研究表明，EVs在肿瘤微环境中促进细胞间通讯，从而调节疾病的发生、发展，并且在治疗反应方面发挥重要作用。

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在大多数神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆)中存在类似的疾病进展模型，其中错误折叠的蛋白质自结合形成有序的聚合体并在细胞中聚集。阿尔茨海默病(AD)中，淀粉样蛋白的Abeta肽的形成可能是这些蛋白聚合体中最著名的。帕金森疾病(PD)中，另一种类型的聚合体在细胞内形成，主要由alpha-synuclein(突触核蛋白)组成，称为路易小体。最近的研究表明，许多神经退行性疾病中涉及的错误折叠蛋白出现在EV中。因此，这些囊泡为检测和监测神经退行性疾病带来了新的希望。

AD是一种迟发性神经系统疾病：由于神经变性而导致记忆和认知能力的逐渐丧失。虽然AD的确切病因仍是一个有争议的话题，但很明显，与Aβ肽相关的斑块沉积和与tau蛋白相关的神经纤维缠结对疾病的进展是非常重要的。这些淀粉样肽来源于淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解过程。这一

如何对exosomes进行成分分析

外泌体（Exosomes）是一种直径在40～100 nm的圆形单层膜结构，可由机体众多类型细胞释放，并广泛分布于唾液、血浆、乳汁、尿液等体液当中。外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。2007 年，Valadi等发现细胞分泌的外泌体中含有生物学活性的mRNA、microRNA，使得研究人员对外泌体的研究热情激增。

传统的外泌体分离要涉及超速离心，操作繁琐、过程冗长，所得到的外泌体纯度较低。美国101Bio提供的系列外泌体分离试剂盒，可从细胞培养基或血清中富集大量完整的外泌体，试剂盒具有

ü 方便——无需超速离心；

ü 快捷——不到2个小时即可完成外切体分离纯化；

ü 高回收率——是超速离心的5~10倍；

ü 高纯度——所得外切体纯度高达95% 以上；

ü 仅需2ml的细胞培养基或200ul血清，即可获得足够的外切体用于下游研究。

PureExo®Exosomes Isolation Kit for Cell Culture Media

试剂盒组分

Solution A、Solution B、Solution C和PureExo® Columns

操作步骤

1. 无血清培养或血清饥饿48小时的细胞培养液于4℃ 600 g 离心10mins取上清；

2. 在玻璃管中按照比例加入细胞上清液及ABC混合液摇匀；

3. 于4℃孵育1h后出现分层；

4. 弃上层培养基，并将其余液体转移至EP管；

5. 1000g离心3mins，出现分层，弃上层培养基及下层无色澄清液体；

6. 上述步骤重复操作一次；

7. 室温干燥5~10mins后用1X PBS重悬；

8. 重悬液转移至纯化柱中，2000g离心5mins；

9. 收集流出液即为外切体。

瑞芯智造高分辨率纳米单颗粒分析仪怎么样？

瑞芯智造(深圳)科技有限公司推出的Nanocoulter Ⅰ 高分辨纳米单颗粒分析仪为纳米颗粒快速定量测量提供了一个平台。测量纳米颗粒时采用电学性质识别电解质溶液中的粒子,而无需依赖其光学参数以及其他物理性质。该仪器可测量单个粒子并快速整合粒子尺寸与浓度的统计数据。这一特殊性能将Nanocoulter Ⅰ与市面上其他纳米粒度仪区分开来。

Nanocoulter Ⅰ主要特性:

 单个检测流体中的纳米颗粒

 一次性检测卡,避免交叉污染

 多维数据,测试过程可视化

 无需对标,全自动分析纳米颗粒粒径分布、浓度以及电位数据

 任何类型的纳米颗粒(无机有机,透明不透明,导电绝缘)

 粒径测量范围:40-2000nm

 浓度测量范围:106-1012个/ml

 检测速度:5分钟之内完成测试

 样本需求量:50μl以内

 台式大小,400(mm)×350(mm)×310(mm)

 重量:19kg

Nanocoulter Ⅰ技术原理:

库尔特原理(亦称:电阻感应脉冲RPS),悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔时,取代相同体积的电解液,在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化,产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。属于对颗粒个体的测量和三维的测量,不但能准确测量物料的粒径分布,更能作粒子绝对数目和浓度的测量。其所测粒径更接近真实,并且不受样本物理化学性质的影响。

光刻纳米孔芯片:

库尔特原理测量粒径范围依赖孔径大小,通过使用最先进的光蚀纳米孔硅基芯片,最高加工精度可达1nm,将传统的库尔特计数只能测量微米级别的颗粒下探到40nm。不同孔径的芯片应对不同粒径的颗粒,检测范围可从40nm-2000nm。

Nanocoulter Ⅰ如何做到单颗粒检测

液体样本中的颗粒在电渗流的驱动下,单个通过纳米孔,产生电脉冲信号(如下图所示),可测量每个通过纳米孔的粒子,提供实时的粒径大小与浓度信息,是真正意义上的单颗粒检测,不受制于颗粒的光学性质与其他物理化学性质,可用于任何材料的粒子的单颗粒测量。

Nanocoulter Ⅰ工作原理展示动画

应用方向:

细胞外囊泡(外泌体)

外泌体近年来在基础研究和临床诊断治疗等方向均展现出极大的潜力,受到广泛关注。外泌体分离纯化是所有研究工作的第一步,因此分离出来的外泌体的鉴定工作显得尤为重要。Nanocoulter Ⅰ可快速得到样品的粒径分布情况和准确的浓度信息,是外泌体研究工作中的得力助手。

病毒

对于病毒的治疗开发、药物载体、以及常规研究而言,病毒及其团聚物的数量和尺寸变化非常重要,Nanocoulter Ⅰ可以快速的提供单个病毒的浓度、团聚物浓度、粒径分布数据。细微的浓度差异(2倍),粒径差异(10nm)都可准确的表征,凭借超高的分辨率现已成为很多许多病毒研发生产企业的质控指标。

脂质体

脂质体是由卵磷脂和神经酰胺等制得,是一种类似生物膜结构的双分子层微小囊泡,可以与细胞膜融合,并且无免疫原性,是优良的药物载体材料。Nanocoulter Ⅰ不仅可以对脂质体样本进行粒径和粒径分布、浓度检测,还可以对是否成功载药进行分析,在脂质体的制备,载药研究上有指导性的意义。

细菌

库尔特原理,一直以来被行业作为细胞计数的金标准技术,Nanocoulter Ⅰ在此基础上发展起来的纳米库尔特技术,搭载不同孔径的纳米芯片,可应对各种细菌的检测,测试时间短、用量少、可活体检测、无需复杂制样,在细菌计数方面有着得天独厚的优势,并且可同时得到细菌的粒径及粒径分布、zeta电位数据。

纳米材料

各种纳米材料在医疗诊断、生物技术、工业生产等多领域都有极广泛的应用,纳米材料的浓度、粒径、粒径均一性影响纳米材料产品的性能,Nanocoulter Ⅰ采用经典的库尔特原理(电阻脉冲感应法),一个微球产生一个电阻脉冲,一次上样即可测得纳米全方位的信息,并且不受材料性质的影响,在纳米材料的研发、生产、应用等领域发挥日益重要的作用。

多分散体系

多分散颗粒混合物是指组成颗粒大小、形状或分子量不同的混合物。这种混合物的粒度分布很难确定;混合物的大量光学特性,例如不透明度,并不能提供关于总体分布的详细信息。当颗粒尺寸减小到亚微米范围时,这一点尤其明显。典型的表征仪器,如动态光散射(DLS)和光学粒子跟踪不能分析高度多分散的混合粒子,而可以NanocoulterⅠ可以。