细胞周期检测试剂盒说明书（细胞周期检测试剂盒说明书电子版）

本文目录一览：

• 1、索莱宝细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒的说明书有吗
• 2、细胞周期染色的过程是什么？
• 3、流式细胞仪检测细胞周期DNA含量结果图怎样分析和说明
• 4、细胞周期检测方法即PI法的操作步骤
• 5、细胞周期测定实验有哪些，怎么做?
• 6、细胞周期检测的原理

索莱宝细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒的说明书有吗

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒

货号：C1052

规格：50T

保存：-20℃保存，一年有效。C1052-2碘化丙啶染色液(20×)需避光保存。本试剂盒可4℃保存，一个月内有效。

产品说明：

细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(Propidium staining，即PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。 碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。

细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察细胞凋亡情况。

本试剂盒通常应用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测。如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化成单细胞状态，才可以进行检测。本试剂盒足够检测50个样品，每个样品的细胞数量可以为10-100万。

试剂盒组成：

试剂名称 规格

染色缓冲液 25mL

碘化丙啶染色液(20×) 1.25mL

RNase A (50×) 0.5 mL

使用方法：（仅供参考）

1. 细胞样品的准备：

a. 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

b. 对于悬浮细胞：1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5毫升离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2. 细胞固定：加入1毫升冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定2小时或更长时间。固定12-24小时可能效果更佳。1000g左右离心3-5分钟，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50微升左右的70%乙醇，以避免吸走细胞。加入约1毫升冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50微升左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

3. 碘化丙啶染色液的配制：参考下表，根据待检测样品的数量配制适量的碘化丙啶染色液：

试剂名称 1个样品 6个样品 12个样品

染色缓冲液 0.5mL 3mL 6mL

碘化丙啶染色液(20×) 25μL 150μL 300μL

RNase A (50×) 10μL 60μL 120μL

Final volume 0.535 mL 3.21 mL 6.42 mL

注：配制好的碘化丙啶染色液短时间内可以4℃保存，宜当日使用。

4. 染色：每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37℃避光温浴30分钟。随后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24小时内完成流式检测，最好能在当日完成流式检测。

5. 流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

细胞周期染色的过程是什么？

细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。细胞周期又可以分为间期和有丝分裂期，细胞间期常划分为休眠期（G0），DNA合成前期（G1），DNA合成期（S），DNA合成后期（G2），整个周期可表示为G1→S→G2→M。DNA周期检测可用来反应细胞周期的各个期的状况，即细胞增殖状况。随着细胞在细胞周期中的进展，G1期细胞具有一组配对的染色体，并且就DNA含量而言是均一的。 另一方面，在S期期间DNA的量开始加倍，因此DNA的量是G1中的量的1-2倍。 与G1中的细胞和两组配对的染色体相比，G2 / M期的细胞具有两倍的DNA量。

Abbkine细胞周期染色试剂盒基于核染料，当其与细胞中核酸的结合时，产生荧光信号，荧光强度与细胞DNA含量。成比例，为分析处于细胞周期各相中细胞百分比提供了一种方便和准确的分析方案

流式细胞仪检测细胞周期DNA含量结果图怎样分析和说明

流式细胞仪检测细胞周期DNA含量结果图怎样分析和说明

已经做完流式，看到结果却不知该怎样分析了。我用的是AnnexinV-FITC 凋亡试剂盒 ，AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡。请教各位，凋亡散点图中第1，2，4象限到底分别代表什么细胞？手里的资料说法都不相同。试剂盒说明书：1代表细胞收集过程中机械性损伤的细胞，2 代表继发性坏死细胞，4代表凋亡细胞。有资料说：1代表坏死细胞，2代表晚期凋亡细胞，4代表早期凋亡细胞。我就不明白了，既然是凋亡，就算是晚期，细胞膜也会破坏？还有的认为，2象限代表晚期凋亡和继发性坏死的细胞。

我用的是美国Beckman-Coulter公司试剂盒，它的说明说上就是这么写的：

Quadrant 3：viable cells

Quadrant 4：apoptotic cells

Quadrant 2：secondary necrotic cells

细胞周期检测方法即PI法的操作步骤

1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。

2. 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。

3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。

4. 流式分析： 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

细胞周期是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后生长，再到下一次分裂结束的循环过程。细胞周期的长短反映了细胞所处状态，这是一个细胞物质积累与细胞分裂的循环过程。癌变的细胞以及特定阶段的胚胎细胞常常有异常的分裂周期。

细胞周期测定实验有哪些，怎么做?

细胞计数法

实验方法原理： 体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

实验步骤：

一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

三、取出盖片，按下列顺序操作：

PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

五、计算

分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%

BrdU参入法

实验方法原理： 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

一、试剂配制

二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10 μg/ml。

三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

五、常规染色体制片。

六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。

七、弃去2×SSC液，流水冲洗。

八、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

九、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

十、计算

细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）

细胞周期 （cell cycle) 是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。

1.间期

间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

（1）G1期

此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后，分化并执行各自功能，此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段，细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。

（2）S期

S期是细胞周期的关键时刻，DNA经过复制而含量增加一倍，使体细胞成为4倍体，每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时，还合成组蛋白，进行中心粒复制。S期一般需几个小时。

（3）G2期

为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕，形成两个中心体，还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定，需用1～1.5小时。

2.分裂期

细胞的有丝分裂（mitosis）需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1～2小时。

（1）前期（prophase） 染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

（2）中期（metaphase） 细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群，共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46，XY，女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

（3）后期（anaphase） 由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。

（4）末期（telophase） 染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合

为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

在体内根据细胞的 分裂能力 可把它们分为三类：

①增殖细胞群 ，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环。

②不再增殖细胞群 ，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）。

③暂不增殖细胞群 ，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。

流式细胞仪

实验方法原理： 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。

实验步骤：

一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心15 min去上清。

二、PBS洗2次，加0.5 mLPBS吹匀，务必吹散。

三、用5 mL注射器将细胞吸起，用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。

四、800 rpm 15 min收集固定细胞，PBS洗2次。

五、用0.4 mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）。

六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50μg/mL ，37℃水浴消化30 min；

七、加PI约50 μL至终浓度约为65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

八、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。

九、样品分析测定及打印。

常见问题

1.Q：胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？

A：以乳腺细胞的DNA含量测定为例，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.

2.PI分析细胞周期及凋亡率相关问题

Q： （1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？

A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q： （2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？

A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定。

Q： （3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。

Q： （4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？

A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。

3.Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？

A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI

  4度孵育30min”。至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。

4.Q：肿瘤细胞测周期。70％乙醇是否必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，PBS和乙醇配会出现絮状物？上流式前细胞用75％乙醇固定，使用瓶装75％乙醇是否可行？

A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

5.Q：流式分析细胞周期，收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现看不到细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？

A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：

（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机

（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。

（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿

（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

细胞周期检测的原理

碘化丙定（ Propidium,简称Pり是一种双链DNA的光料。碳化丙和双链DNA结合后可以产生光，并且光度和双链DNA的含量成正

比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细仪对细抱进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情兄，可以进行细周期和细

凋亡分析。碘化丙定染色后，假设60G1期细抱的荧光米度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期的気光量度的理论值为2,正在进行

DNA复制的S期出的英光强度为1-2之间。凋亡细击于细核发生浓缩以及发生DNA片段化 DNA fragmentation)导数部分基因组DNA片

断在染色过程中丢失，因比调亡细抱供化丙定染色后呈现明显的词染，即荧光蛋度小于1,在流式检观的光图上出现所谓的sub-G1峰，题凋亡

细胞峰。细抱发生凋亡时，由于浆和染色质浓、核碎裂，产生凋亡小体，使细抱的光射性质发生变化。在细凋亡的早期，细对前向角

光散射的能力显著降低，対侧向光散射的能力加或没有変化。在细抱周亡的究期，前向和侧向光散射的信号均降低。因此可通过流式细抱仪测

走细光数射的变化观察细한周亡情况。

本试剂盒通常应用于培养的贴或浮细的细胞周期与细抱周亡检则。如果用于组织的细抱周期与细抱周亡检则，则必须把组织消化成单细记

状态，才可以进行检见。