外泌体怎么分离（外泌体是怎么形成的）

本文目录一览：

• 1、什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍
• 2、原生质体灭活方法有哪些
• 3、使细胞中组织分离开来,跟细胞分离开区别
• 4、外泌体是个什么“鬼”
• 5、如何特异性分离小胶质细胞分泌的外泌体

什么是外泌体保存液，外泌体保存液介绍

外泌体的实验的基础，很多童靴认为这是最简单的。如果你真的这么认为，那么就大错特错了。收集样本有不同的要求，一个比一个重要。那该如何去选择我们的实验样本？取样的时候又该注意些什么？分离好后的外泌体又如何保存呢？

一、外泌体样本的选择和注意事项

实验样本不同在收集的时候需要注意的点不同。你研究的是哪种样本，需要特别注意哪些方面呢？看以下阐述：

1、细胞上清

选用细胞培养上清作为分离外泌体的实验材料不会像血样等存在样本量限制的问题，而且操作简单，直接离心即可。但在细胞培养过程中需注意污染、培养时间、细胞死亡率及FBS的问题。和所有的细胞实验一样，培养过程中不允许有污染，但有些培养细胞本身带有病毒基因组，在培养过程中会释放出病毒颗粒，这就要衡量病毒颗粒是否会影响后续实验。

一般培养24-48h后细胞即可分离外泌体，在特殊情况下，如在培养基中添加特殊的化学物质，培养15-60min即可收集。因细胞死亡会分泌小体，所以在研究外泌体时细胞的死亡率一定要控制 5% 之内。未经处理的FBS中含有大量的外源外泌体，所以细胞培养一定要用经过处理不含外泌体的FBS。

2、唾液

唾液的成分会因取样的位置和时间不同而不同，所以同血样一样需定点定时。唾液主要由舌下腺，颌下腺及腮腺3个腺体分泌，所以不同位置的唾液成分不同，在收集的时候需固定位置或是收集所有的唾液。不同时间段的唾液成分也会不一样，所以也需定时取。其他如吸烟进食都是禁止的，一般建议采样1h之内不能有进食行为，包括饮料，且不要剧烈运动，在平息状态下取样。最后一点，不能刷牙。

3、血液

在第一次外泌体课程的时候，就有许多同学问到关于血清和血浆选择的问题，那到底应该选哪个呢?血浆=血液-血细胞 血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子

分不清楚两者的弄清血清的来源就能牢牢记住啦。血清是血液凝固之后收集的液体，所以其中少了纤维蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体，有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。所以一般实验选择血浆，在特殊情况下，如研究与血小板相关的疾病的时候，当然是血清更适合。

受限于样本，血样一般取2ml。那取血样的时候有什么注意的地方呢？在外泌体的血样研究中，经常被忽略的一个问题就是针头的大小。在抽血过程中，血液流经针头的时候会产生剪切力，若针头太细，剪切力较大，会使细胞破碎或刺激血小板分泌外泌体，从而影响后续的实验。有些文献报道21号针头的大小比较合适作为外泌体研究的血样收集。其他诸如采血的位置，人的生理周期，饮食周期及时间周期（24h）等都会影响样品中的外泌体。所以取样的时候尽量定点定时。最后还需注意，尽量在采血30min内处理样本，因血液收集在收集管中时，血细胞和血小板还会分泌外泌体。

4、鼻涕

研究鼻涕有一个特殊的价值，其可以探索治疗性外泌体。啥是治疗性外泌体？在脑部的疾病治疗中，药物可以外泌体的方式注射到鼻腔，这样药物就可以避开血脑屏障。鼻涕的收集与许多环境因素相关，如年龄、季节、性别 、城市、过敏史及职业风险。鼻涕的收集方法没有统一标准，只需保证所有样本取样方法一致即可。

5、尿液

在尿液的取样中，除性别、年龄、进食等影响外，还有一个特殊的点即是尿液的新鲜程度，这个新鲜度指的是尿液在膀胱中存在的时间。

6、乳汁

乳汁中存在的外泌体、抗体等会影响新生儿的发育，具有较大的研究价值。泌乳的阶段、 胎次、膳食、泌乳量、是否是母乳喂养、母亲的健康状态、精神状态等都会影响外泌体的分泌。需要注意的是乳汁中含有大量的脂蛋白，会对后面分离外泌体产生影响。

7、脑脊液

脑脊液研究面临的困难主要在样本的获取及样本中外泌体丰度少，有木有一种雪上加霜的感觉。那这个问题如何解决？国外可购买商业正常样本或者使用其他疾病样本作为对照。

二、外泌体的保存

对于外泌体的保存，和其他分子样品一样，提取的外泌体低温保存即可，短时间（一周之内）可放4度，长时间放-20或-80。也有人认为放4度更好，怕低温冻融会影响外泌体的完整性，但目前还没有一个定论，而且大部分文献认为没有影响。那到底放几度呢？有一招，分装放-20或-80，是不是妥妥的。

原生质体灭活方法有哪些

原生质体灭活方法有哪些

一、超速离心法，这是目前外泌体提取常用的方法 。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块， 由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种 方法得到的是微泡不是外泌体 。

二、过滤离心， 这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性 ，但同样存在纯度不足的问题。

三、密度梯度离心法， 用此种方法分离到 的外泌体纯度 高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。

四、免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态 的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH 和非 生理性盐浓度会影响外泌体生物活性， 不便进行接下来的实验 。

五、PS亲和法，该方法将PS（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。2016.9 nature杂志发表了该方法的新数据，表明PS法可提取相当高纯度的外泌体。

六、色谱法，这种方法分离到的外泌体在 电镜下大小均 一， 但是需要特殊的设备 ， 应用不广泛 。

使细胞中组织分离开来,跟细胞分离开区别

分离是把细胞间的蛋白质等物质破坏，使细胞不再连在一起，分散是使细胞散开，形成单层的分离是原来细胞都粘连在一起，分离后细胞紧靠在一起但不粘连，压一压就可以把它们分散开来，叫分散外泌体的作用途径和方式：

外泌体由来源细胞释放入外环境后，距离较近的可由近分泌途径直接被受体细胞吸收，距离稍远的可由旁分泌途径被吸收，还有部分外泌体循环入体内作用于全身系统由内分泌途径被吸收。对于近距离的吸收，起初研究者认为外泌体是与受体细胞非特异性结合发生胞膜融合后进入细胞。但近来发现，这一过程其实与受体细胞表面特异性分子(如T细胞膜蛋白Tim4)的调节或受体细胞上4次跨膜蛋白有关，这说明外泌体的摄取并非完全随机发生。外泌体被受体细胞吞噬后可到达吞解体，也可到达晚期endosome的囊腔中，但exosome是由吞解体裂解还是由晚期endosome释放于受体细胞质中，以及是什么原因导致了这种不同的吸收路线，目前还不清楚。且组织特异性是否参与远距离的靶向吸收循环系统中外泌体，仍是另一个潜在的研究方向。目前认为外泌体主要通过四种方式在细胞间发挥信息传递作用，1)外泌体作为信号复合物，通过细胞表面配体直接刺激受体细胞；2)外泌体在细胞间转移受体；3)外泌体向受体细胞运送功能蛋白或传染性颗粒；4)外泌体通过mRNA、microRNA或转录因子向受体细胞传递遗传信息。一旦外泌体被受体细胞吸收后，其内载有的脂质、蛋白质、mRNA、microRNA等成分可以通过改变转录和翻译程序。影响蛋白修饰，调节信号级联通路、关键酶反应以及细胞自动调节等方式影响受体细胞的细胞表型和功能，而来源细胞和受体细胞的种类及其生理病理状态将决定具体是哪种机制发挥主要作用

外泌体是个什么“鬼”

外泌体

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。 有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。 外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

当外泌体在1980年首次被发现后，其被认为是细胞排泄废物的一种方式，如今随着大量对其生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换，从而导致大量新生血管的生成，促进了肿瘤的生长与侵袭。

如何特异性分离小胶质细胞分泌的外泌体

如何特异性分离小胶质细胞分泌的外泌体

小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，相当于脑和脊髓中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中的第一道也是最主要的一道免疫防线。小胶质细胞大约占大脑中的神经胶质细胞的20%。小胶质细胞不停地清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用，如帕金森病，多发性硬化和阿兹海默症等。但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。他们是促炎因子和氧化应激的重要来源，如肿瘤坏死因子（TNF），一氧化氮，白介素等有神经毒性的物质