免疫细胞检测的关键步骤（常见的细胞免疫检测方法）

本文目录一览：

• 1、流式细胞仪的原理和操作过程
• 2、如何正确的进行elisa检测
• 3、mtt法原理和步骤是什么？
• 4、检验医学知识历年试题(77)-2021天津医疗卫生
• 5、CUT&RUN实验原理和步骤

流式细胞仪的原理和操作过程

原理：

流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

操作过程：

①打开电源，对系统进行预热；

②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；

③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；

④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的 基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；

⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选 择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；

⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；

⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭 气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；

⑧将所需结果打印出来。

如何正确的进行elisa检测

临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。

一.临床标本的收集和保存

用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面：

（1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。

（2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。

（3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。

（4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。

（5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。

二、试剂准备

在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。

三、加血清样本及反应试剂

在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

四、温育

温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。

温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：

（1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原因为何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。

（2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。

（3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。

总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。

五、洗板

固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。

在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。在特定临床实验室所使用的洗板机，到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可以认定该实验室所用洗板机3次洗板即可达到要求。

六、显色

在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。

此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行。关于TMB和OPD的显色反应特点及注意点可参考前面有关章节内容。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。

七、比色

ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。至于如何正确理解和使用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点：

（1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。

（2）单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。

八、结果判定

临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内在临床上应用的ELISA试剂盒绝大部份是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部份用于αFP、hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。有关ELISA定性和定量测定结果的数据处理后面将有专门章节讨论。本处只想强调的一点是，ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”结果的判定依据只能是试剂盒本身所确定的Cut-off值，而不能以卫生部临床检验中心供应弱阳性定值质控血清。为什么要强调这一点呢？主要是因为以前有很多基层实验室均使用部中心供应的弱阳性定值质控血清（以前也称“临界值”血清）的测定吸光度来判定结果，高于其判为阳性，反之为阴性，而不管试剂盒Cut-off值为何。到目前为止，仍有一些实验室在坚持这种错误的做法。试剂盒的Cut-off值的设立是建立在一系列科学试验及统计学研究的基础上的（详见后述），而部中心供应的弱阳性定值质控血清主要是供临床实验室进行室内质控时使用。

下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写。

（1）S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。

（2）S/N或P/N：其中S同（1），N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。

九、结果报告及解释

临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定则报出具体的数值。结果解释比较起来要复杂的多，它要求实验室技术人员对所测定的项目有较为全面的知识基础。例如，对乙肝“两对半”结果的解释，不但要求检验者要知道不同的结果模式的临床意义，而且必须对乙肝病毒的分子生物学、分子的变异及其对表型的影响有更深层次的了解。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验工作的检验医师，对所做的测定项目除了知其然，还要知其所以然，否则就难免为时代所淘汰。

综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。

临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因

问 题

可能的原因（非试剂盒本身的原因）

1．弱阳性质控样本检测不出

温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题

2．测定的重复性差

（相同样本两次测定结果不一致）

这是典型的由测定操作引起的问题，包括

（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；

（2）加样过快，孔间发生污染；

（3）加错样本；

（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；

（5）不同批号试剂盒中组分混用；

（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；

（7）孔内污染杂物；

（8）酶标仪滤光片不正确；

（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。

3．白板

（阳性对照不显色）

（1）漏加酶结合物；

（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。

（3）漏加显色剂A或B；

（4）终止剂当显色剂使用。

4．全部板孔均有显色

（1）洗板不干净；

（2）显色液变质；

（3）加底物的吸光受酶污染；

（4）洗板液受酶等污染。

摘自《检验诊断与实验室自动化》2004年第4期

mtt法原理和步骤是什么？

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％。

CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）。

（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。

（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。

（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制。

扩展资料：

MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，外源性MT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒( Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。

二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在570nm(参比波长630m)波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MT结晶形成的量与活细胞数成正比。

参考资料来源：百度百科-MTT法

检验医学知识历年试题(77)-2021天津医疗卫生

1. 关于酶免疫技术的特点，正确的是：()

A.酶标记物催化抗原抗体反应，使其结果放大，提高了检测的灵敏度

B.酶活性易受理化因素的影响，酶标记物稳定性差

C.底物经酶催化后的成色，使酶标记免疫反应结果得以放大

D.选择高质量的标记用酶是建立酶免疫技术最重要的前提

E.酶免疫技术检测方法较为繁琐

2. 参与三联吡啶钉电化学发光过程的物质是：()

A.碱性磷酸酶

B.三丙胺

C.吖啶酯

D.鲁米诺

E.HRP

3. 免疫电镜技术中，最常用的免疫染色技术：()

A.酶标记抗原免疫组化技术

B.金免疫技术

C.荧光免疫组化技术

D.非标记抗体酶免疫组化技术

E.铁蛋白标记免疫技术

4. 免疫组化技术的关键步骤是：()

A.标本采集

B.免疫染色

C.设立对照试验

D.结果判断

E.标本固定

5. 流式细胞仪的单参数数据显示方式是：()

A.二维的散点图

B.等高线轮廓图

C.分布直方图

D.密度图

E.三维立体显示

6. 分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为：()

A.1.030

B.1.035

C.1.092

D.1.020

E.1.077

【参考答案与解析】

1.【参考答案】C。解析：酶标记技术是通过酶反应的专一性和抗原抗体结合的特异性完成了检验技术，主要是通过酶标记催化显色从而方便观察检测结果。该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。

2.【参考答案】B。解析：参与三联吡啶钉电化学发光过程的物质是三丙胺。碱性磷酸酶和HRP是酶免疫技术中最常用的酶，鲁米诺是化学发光酶免疫测定中最常用的发光底物，吖啶酯是化学发光免疫测定中的发光底物，在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。

3.【参考答案】B。解析：铁蛋白标记免疫技术也用于免疫电镜技术中，但最常用的金免疫技术。

4.【参考答案】B。解析：应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。免疫组织化学染色技术的步骤包括标本采集、标本固定、免疫染色、设置对照以及结果判断，其中关键步骤是免疫染色。

5.【参考答案】A。解析：流式细胞仪是根据鞘液中包裹的细胞的不同在电场中的运动不同会在显示屏上显示出二维的散点图。

6.【参考答案】E。解析：血小板密度为1.030～1.035。淋巴细胞和单核细胞密度为l.075～1.090。粒细胞为l.092，红细胞为1.093。因此利用密度在1.075～1.092之间，近于等渗的溶液进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度分布，从而被分离。

CUT&RUN实验原理和步骤

Concanavalin A或者说是ConA beads被lectin（凝集素）包裹，这个beads可以结合细胞膜/细胞核上的glycoconjugates（糖复合物）。膜是通透的，染色质可以被特异的抗体结合，在我们的这个例子里，选择的是PTMs。下一步，加入AG蛋白-micrococcal核酸酶（也叫做pAG-MNase），这个pAG-MNase结合到抗体连接的染色质上，然后通过适量浓度的Ca2+来激活pAG-MNase，从而切割DNA。被切下来的DNA游离到上清里，通过离心我们可以把这些抗体结合的DNA分离出来。

之后提取DNA，制备文库，然后进行测序。

最后就可以进行数据分析了。

CUTRUN实验可以用来分析多种蛋白的染色质图谱，包括PTMs，转录因子，染色质remodelers和染色质writers/readers。

如果你是第一次使用这个技术，请全面考虑你的细胞类型、实验条件、对照、抗体，从而解决你的生物学问题。这个试剂盒可以兼顾多种细胞类型（我现在的实验室里用的就是这个试剂盒）。

对于未固定的细胞，是研究组蛋白PTMs和转录因子理想的实验材料。这种细胞可以有多种来源，包括贴壁、悬浮细胞，组织样品。

CUTRUN也可以用lightly-crosslinked细胞（翻译成轻微固定的细胞？），样品固定一般用于研究一些染色质瞬时作用因子和某些PTMs。

当然你也可以提取nuclei，这种方法用于研究那些量很少的PTMs和蛋白。另外，当你的实验材料是免疫细胞时，也推荐提取nuclei，因为ConA beads可以激活某些免疫细胞。还有要提一下的是所有的材料都可以低温储存。

细胞数量上，推荐每个样品50万细胞。当然你需要尝试不同的细胞数量来优化你的实验。对于这个试剂盒来说，最少你可以用5000个细胞来进行实验。

对照和标准化是整个实验的关键步骤。阳性对照推荐使用H3K4me3或者H3K27me3,；阴性对照推荐使用Rabbit IgG。你还可以使用spike-in来进行标准化。

CUTRUN有6种主要试剂。这里需要注意的是，根据你的实验材料是细胞、nuclei、或者固定的细胞，所使用的试剂是不一样的（这里试剂列表就不贴了，有需要的同学可以去 试剂盒官网看具体细节 ）。另外，有些试剂是需要现用现配的，官网说明书里写的很详细。

beads的活化在1.5ml tube里进行，你还需要与之匹配的magnetic rack。尽量不要用8连管，那样会损失很多。活化buffer要放置在冰上。

首先震荡beads（设置6档或7档），然后快速离心一下。然后把beads放在magnetic上，待溶液澄清了，吸走上清。然后用活化buffer清洗beads 30秒（清洗两次）。最后清洗完，还是用活化buffer重悬beads。这里要注意，beads要放置在冰上。下面是第一部分的总结图：

这一部分用的wash buffer请放置室温，防止刺激到你的细胞。这一步如果用8连管，每一管的细胞应在4.4milion。你可以首先收集你的细胞，同样是用wash buffer清洗细胞两次，最后用wash buffer重悬你的细胞。之后把beads加入到细胞悬液里。轻微震荡或用移液枪吹打。室温静置10分钟。

下面是第二部分的总结：

上一步静置后，把beads放在magnetic上，移除上清。加入冷的抗体buffer，这一步要快，防止beads干燥，但是不要太剧烈，防止细胞裂解。然后加抗体，阴性对照抗体1:10添加，阳性对照抗体1:100添加。轻微震荡，放在摇床上孵育过夜（4度，16小时）。下面是第三部分的总结：

首先快速离心8连管，把管放在magnetic上。待溶液澄清，移除上清。加入冷的dinitonin buffer。清洗2遍。清洗后用dinitonin buffer重悬beads。

pAG-MNase和digitonin buffer应放置在冰上。在样品里加入pAG-Mnase，室温孵育10分钟，快速离心，放置magnetic上，移除上清。使用digitonin buffer清洗beads两遍。然后用digitonin buffer重悬beads。

把样品放在冰上，加入CaCl2，这一步很关键，因为Ca会活化pAG-MNase，轻微震荡后，摇床上4度孵育2小时。之后加入stop buffer。如果你想加入spike-in，那么加完stop buffer后可以加入spike-in DNA。

37度10分钟。之后把tube放在magnetic上，把上清液移到新的管里。之后使用DNA purification kit。

上一步纯化DNA后，推荐10ul体积洗脱。使用1ul进行Qubit检测浓度。一般来说，如果每个样品的细胞数约0.5个million的话，下面有一些浓度参考：

下面就是制备文库了。就是跑PCR。这里要注意的是，如果你要研究的是转录因子，那么你要优化你的PCR条件，因为转录因子的文库片段小于120bp。然后使用bioanalyzer来检测片段富集：

最后就是测序了。一般每个样品3-5个million就可以了。

上面已经提到了，如果你的细胞是免疫细胞，要提前提取nuclei，因为ConA beads上的lectin在结合细胞的时候，会对免疫细胞有影响。pAG-MNase会通过核孔进入到核中。需要注意的是，digitonin buffer浓度要保持0.01%，防止beads粘附到tube上。

需要注意的是，我们平时做ChIP-seq的交联方法是不适用于CUTRUN的。这里使用的是lightly crosslinking。

这里要注意的是，冻存细胞是90%培养基+10%DMSO中放置在-80度里保存的。不要用液氮快速冷冻你的样品，因为会使你的细胞裂解、染色质外漏，会导致你的背景信号非常高。在进行CUTRUN步骤之前，37度快速解冻细胞。

对于贴壁细胞，不要用胰酶消化细胞！！！因为细胞表面的glycoprotein要结合beads。所以贴壁细胞只能用“刮”的。