脂肪干细胞外泌体制备技术（脂肪干细胞外泌体制备技术原理）

本文目录一览：

• 1、如何提高iPS细胞的制备效率
• 2、日科学家：一种脂肪激素可提升干细胞疗法的潜力
• 3、脂肪干细胞的材料和方法

如何提高iPS细胞的制备效率

经过了漫长又短暂的发展，iPS细胞技术已经取得了举世瞩目的进展。一个个突破性的成果既给我们带来了喜悦，也带来了新的挑战，细胞重编程有望迎来一个新的研究浪潮。尽管iPS细胞有着诱人的应用前景，然而，未来iPS细胞的研究也面临着许多亟需解决的问题，首要就是制备效率。

1. 基因的阻断

自从iPS细胞发现以来，科学家们已经通过导入转录因子成功地将多种体细胞诱导为iPS细胞，但诱导效率很低一直是iPS技术的主要障碍。转录因子c-Myc是一种原癌基因，人们试图将这一基因去除以降低致癌性，然而，c-Myc去除后致癌性虽然降低了，诱导效率却更低了。2009年9月，Hong等H

J发现，去除c-Myc基因后用siRNA

阻断一个名为p53的基因，可以将皮肤细胞转化为iPS细胞的成功率提高至10％左右，大约是原有转化率的百倍。研究证明，p53是调控细胞程序重排的关键因子，它关系到转化效率的高低。DNA芯片的分析结果发现，在小鼠和人的成纤维细胞中有34个与p53调节有关的基因，对这些基因的功能分析表明，阻断p53—p21通路不仅提高了iPS细胞的转化效率，也降低了iPS

的致癌性。更为重要的是，沉默p53基因不仅可用于病毒载体诱导技术，而且对质粒或是蛋白诱导转化的技术也同样可行。

2. 协同作用

北京大学邓宏魁教授在诱导人iPS细胞时，筛选了一系列的相关基因，发现p53基因的干涉小RNA和基因的导入可以协同作用，将iPS细胞的诱导效率提高近100倍，即使不用原癌基因c-Myc，也能高效、稳定地诱导人iPS细胞的形成。

3. 脂肪干细胞的诱导

斯坦福大学研究人员Sun等l5州发现，与皮肤成纤维细胞相比，脂肪干细胞(Humanadipose stem

cells，hASCs)更容易被诱导为iPS细胞，且产生的iPS细胞安全性更高。他们发现，在脂肪干细胞和皮肤成纤维细胞中分别加人能够编码4种转录因子的基因后，约有万分之一的皮肤成纤维细胞转变为iPS细胞，而转变为iPS细胞的脂肪干细胞比例达到2％。，是前者的20倍。诱导iPS细胞涉及的4种转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c—Myc)在皮肤成纤维细胞中基本不表达或表达水平很低。脂肪干细胞内两种转录因子的表达水平高于皮肤成纤维细胞，这表明，在初始状态下，脂肪干细胞更容易被诱导。利用脂肪干细胞诱导的iPS细胞能够分化成人体内的神经细胞、肌肉细胞以及肠上皮细胞等。此外，利用脂肪干细胞培养iPS细胞不需要饲养细胞，这无疑提高了其安全性。因hASCs为iPS细胞提供了更好的体细胞来源，将来当iPS细胞应用于临床治疗时，可选择适当的供体细胞种类，既保证了较高的诱导效率也提高iPS细胞的安全性。

4. iPS细胞诱导的氧环境

培养环境的氧浓度对iPS细胞的诱导效率也有影响。Yamanaka等人发现机体内的干细胞总是集中于氧气相对少的地方，于是，他们在利用人体皮肤细胞培养iPS细胞时把培养环境的氧浓度从通常的21％降到5％，发现iPS细胞的生成效率可提高到原来的2．5倍至4．2倍。但如果进一步降低氧浓度到1％，就会适得其反导致部分细胞死亡。诱导鼠的皮肤细胞时同样也验证了5％的氧浓度是最合适的。因此，他们认为，通过降低培养环境的氧浓度，并且使用细胞癌变可能性较小的培养方法，就可高效地获取更高品质的iPS细胞。2009年10月，美国斯克里普斯研究所丁盛博士领导的研究小组

将焦点集中在了可生成结缔组织的成纤维细胞生成的自然过程一间质一上皮细胞转化的研究上，他们发现两种化学物质的组合，在促进成纤维细胞转化成干细胞方面的效用最高，比传统方法的效率高100倍。随后，研究人员又锁定了一种名为Thiazovivi的新型化合物，可提高效率200倍，同时将转化周期由原来的4周缩短到2周

。

5. 添加物的作用

2009年12月，中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿带领的研究小组另辟蹊径，将研究方向放到细胞外环境一培养基成分上，通过在培养过程中添加维生素C可使iPS诱导效率提高10倍，并通过老鼠和人细胞实验发现，培养时添加维生素C可促进相关基因表达推动体细胞进入重编程状态。他们用缜密的实验设计证明了外因在iPS中具有重要作用。此外，美国哈佛大学研究人员还发现，添加特殊的化合物可将体细胞诱导iPS的效率提高100多倍

。在诱导过程中，他们使用了4种遗传基因，同时加入了7种包括可阻碍特定蛋白质合成的化合物，结果显示，没有添加化合物时，遗传基因的导入效率为0．01％～0.05％，而加入了一种叫“巴尔普罗酸”的蛋白质合成阻碍剂之后，导人效率竞升至9．6％～14％。同时，最新的报道也发现，丁酸盐处理可以显著提高人iPS诱导效率。

日科学家：一种脂肪激素可提升干细胞疗法的潜力

外国科学家发现血小板在肿瘤血管中的新功能Science：失去的眼睛竟然还能重新长出来！国外研究团队发现，第一次怀孕和后期怀孕的免疫细胞作用不同！PNAS：治疗肥胖的激素可能增加败血症的风险

间质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC）有潜力分化为一系列不同的细胞类型，包含骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞等。它们 *** 受损组织的修复功能引起了全球科学家的关注，且已知MSC在治疗心脏病、肝硬化和糖尿病等疾病有其治疗效果。然而，即使有部分临床试验显示确实有效，但科学家们仍难以解释为何都是使用MSC疗法，却可能产生不同的结果。

在一项发表于《Molecular Therapy》期刊上的最新研究，来自日本大阪大学和京都大学的研究人小组调查了在MSC疗法治疗结果不一致的可能原因，研究结果显示其原因可能要归咎于宿主因子。

脂缔素与T-钙黏着蛋白扮演重要角色

论文第一作者、大阪大学的Yuto Nakamura解释：「我们最近报导，脂缔素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种有益激素，在肌肉再生过程中扮演重要角色。该激素会与细胞表面的受体蛋白－T-钙黏着蛋白(T-cadherin)结合。有鉴于T-钙黏着蛋白大量存在于MSC的表面上，我们在心力衰竭模型中研究了脂缔素是否参与MSC的再生活性。」

脂缔素在血液中的浓度很高，已被证实能 *** 一种小膜结合的囊泡－外泌体(exosome)的产生，这些囊泡在细胞之间携带蛋白质、脂质和DNA。 有趣的是，干细胞分泌的外泌体携带着 *** 受体细胞修复的信号。

来源：Molecular Therapy, 2020, doi:10.1016/j.ymthe.2020.06.026

透过首先测量基于细胞培养的系统中的外泌体产量，研究人员证实，脂缔素的增加导致相应的MSC来源的外泌体丰度的增加，而这取决于T-钙黏着蛋白的表达。

心力衰竭的改善与外泌体数量的增加有关

科学家向患有心力衰竭的小鼠注射MSC，可使它们左心室心脏功能得到显著的改善，这与循环中外泌体数量的增加有关。不过最重要的是，MSC治疗后的心脏功能可透过提高血液中脂缔素含量而得到更进一步的增强。

研究共同作者、大阪大学的Shunbun Kita说：「总之，我们的研究显示，MSC透过产生外泌体来发挥其对心脏功能的治疗作用，而该外泌体的产生受到宿主血浆脂缔素含量的影响，且依赖于MSC T-钙黏着蛋白的表达。」

未来可结合促进脂缔素生成与MSC治疗

Shunbun Kita接着说：「基于这些研究结果，未来可以将增加脂缔素生成的药物与MSC治疗联合使用，以显著增强治疗潜力，不仅适用于严重的心力衰竭，还可以治疗多种涉及组织损伤的疾病，包括与COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合症状。」

不过要注意的是，过多的脂肪实际上有害于脂缔素的产生，因此不要轻易选择高脂饮食！

脂肪干细胞的材料和方法

1.1 实验仪器与材料

倒置荧光显微镜(IX71, Olympus);数字彩色摄像系统(Sony3CCD);图像分析软件(Image-pro-plus);离心机(Z23, Herm 德国);Transwell (3450-clear, corning, Costar 美国);纯水机(Millipore-Q-Synthesis, Millipore Ltd.法国);六孔板(Corning Incorporated 3516, Costar 美国)。

DMEM 培养基(高糖，GIBCO 公司);胰酶(GIBCO 公司);乙二胺四乙酸钠(上海试剂一厂);胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司);Ⅰ型胶原酶(Sigma 公司);油红O(Sigma 公司);地塞米松(Sigma 公司);胰岛素(Sigma 公司);吲哚美辛(Sigma 公司);异丁基甲基黄嘌呤(Sigma公司)。

实验所采用的脂肪组织均来源于大连沙医生美容医院，并征得患者同意。

1.2 脂肪细胞培养

将吸脂来源的脂肪组织用D-Hanks 冲洗，去除残留的血细胞和组织碎片，把脂肪组织放入离心管中，记录原始体积。向组织中加入等体积的0.1%Ⅰ型胶原酶，放入37℃气浴振荡器中消化30 min。然后将消化好的组织静置5 min，待其分层后，用吸管吸取位于悬液上层的脂肪细胞，将含有脂肪细胞的悬液以1000 r/min(167g)，离心2 min 后弃掉下层悬液得到脂肪细胞。

1.3 脂肪干细胞的分离和培养

参照文献，同上述脂肪细胞的分离一样，将脂肪组织冲净，称重后消化。当消化完成后，弃掉上层未消化的脂肪组织，将下层的细胞悬液以1500 r/min(375g)，离心10 min 后弃上清，得到离心管底部的脂肪干细胞团，将其重悬，密度调整到1×105mL-1，然后接种在培养面积为25 cm2 的细胞培养瓶中。

当干细胞长满培养瓶后按一传二进行传代，具体的传代方法是：首先，用D-Hanks 冲洗一遍细胞，然后加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化，当在显微镜下观察到细胞发生明显的变形，缩成球状后，立即用含有10%胎牛血清的培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打瓶底部，确保细胞完全脱落分离到悬液中，再把细胞悬液置于离心机上，以1000 r/min (167g)，离心5 min。最后，将离心得到的细胞团重悬，调整密度为合适密度进行接种。

1.4 脂肪干细胞和脂肪细胞的共培养

将准备好的脂肪干细胞和脂肪细胞分别置于Transwell 的上室和下层中，脂肪干细胞与脂肪细胞的个数之比分别为1:5，1:1，2:1 和5:1(4 组分别命名为A、B、C 和D 组)进行共培养，其中每孔中脂肪细胞的数量均为1×105 个。以上每组均做平行实验(n=3)。

1.5 成脂诱导对照实验

将干细胞以1.5×105 每孔的密度接种在六孔板中，以正常培养基培养的样本为成脂分化实验阴性对照组，以成脂诱导培养基培养的样本为阳性对照组。具体方法是：向基础培养基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰岛素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的异丁基甲基黄嘌呤，配制成脂诱导培养基，每周换2 次液，直到进行成脂染色观察为止，以上对照组均做平行实验(n=3)。

1.6 油红 O 和台盼蓝复合染色

用 0.5%油红O，对成脂诱导后的各组样本进行染色。具体操作方法是：先用D-hanks将样本细胞冲洗充分，然后加入油红稀释染色10~15 min，(油红O 稀释液配制方法:0.5%饱和油红O 原液按3:2(油红O:蒸馏水)加入蒸馏水，然后过滤，待用)，接下来用75%的乙醇溶液将样本分化至间质清晰，然后蒸馏水冲，最后再用台盼蓝对脂质以外的细胞核部分进行复染，并于100 倍镜下观察拍照。以每组样本随机选取5~10 视野进行拍照观察以考察共培养方法的成脂诱导分化效果。

1.7 流式检测

通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为1×105 mL-1，800r/min(120g)，离心5 min，弃掉上清，用4℃的冷D-Hanks 冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800 r/min，离心5 min，之后弃去上清。然后用D-Hanks 将细胞重悬至1 mL，加入抗体5~10 μL，避光，冰上放置30 min。用D-Hanks 冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2~3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约200 至300 μL 的D-Hanks 制成悬液，用流式细胞仪检测。

1.8 Hoechst/PI 死活染色

弃掉旧培养基，用D-Hanks 冲洗除去残留培养基然后向每个Transwell 孔中加入质量浓度为1 mg/mL 的Hoechst 33342 大约10 μL，使其终质量浓度为10 μg/mL，37℃下避光反应10 min。待Hoechst 染色完成后，用D-Hanks 冲洗除净残余的Hoechst 染料接下来，再加入用PI 染液，使其终质量浓度为10 μg/mL，4 ℃下避光反应15 min，染色完成也用D-Hanks冲净残余染液最后，将染好的细胞置于倒置荧光显微镜下观察、拍照。

2 结果与讨论

所示的脂肪细胞，与文献中描述的脂肪细胞相一致，图中所示的脂肪干细胞与文献中描述的相一致。均形态完整，生长状态良好，适合进行共培养的后续研究。为成脂诱导阴性对照组，表明脂肪干细胞不能自发生成脂质;图为成脂阳性对照组，在成脂诱导剂作用下，脂肪干细胞能够生成脂质，经统计约有20.3%的脂肪干细胞发生了成脂分化。为共培养后脂肪干细胞染色图片，其中脂肪干细胞与脂肪细胞之比分别为1:5，1:1，2:1 和5:1(其中每孔中的脂肪细胞数均为1×105 个)，尽管在不同比例下对脂肪干细胞和脂肪细胞进行tranwell 间接共培养，然而经过8 天共培养后，脂肪干细胞并不能象成脂阳性对照组那样产生脂质油滴。

此实验结果的原因可能是由于共培养的持续时间过短所致。据文献报导，成脂诱导分化的持续时间通常在1~2 周，即7~4d 左右。因此，有可能由于本实验中脂肪细胞与脂肪干细胞共培养时间过短，导致脂肪干细胞与脂肪细胞没能得到充分作用，所以不能实现成脂诱导分化。

基于上述分析，需延长共培养时间至20d，进一步考察共培养方式中干细胞成脂分化的可行性。

为脂肪细胞与脂肪干细胞经过20d 共培养后脂肪干细胞的Hoechst/PI 死活染色结果。Hoechst 染料对活的细胞具有特异性染色的特点，PI 则对死细胞特异性染色。从中可以看到，两组中的细胞均呈明亮的蓝色，说明细胞的活性很好。基本上看不到PI 染成红色的死细胞的存在。表明，本实验中，经过共培养后的脂肪干细胞，仍拥有良好的活性。

研究可以发现，共培养组a，d，g 3 组均未发生明显的成脂分化现象。通过观察b，e，h 3 幅图发现，经过成脂诱导剂诱导的3 个不同接种密度的阳性对照组中均出现成脂分化，图中可以看到成脂分化后的细胞内出现大量密集在一起的小脂滴，当小脂滴达到一定数量后，就会聚合成为较大脂滴。这些成脂分化的现象与文献中报道的脂肪干细胞成脂分化的过程相一致。通过观察c，f，i 3 组未加任何诱导剂，仅仅使用基础培养基培养的脂肪干细胞的阴性控制对照组，可以看到，脂肪干细胞均匀生长于培养界面上，经过20d 的培养细胞的生长状态良好，未发生明显细胞破碎和衰退死亡的改变。

a，b，c 和d 为各个共培养组的对照组的流式结果图，图e，f，g 和h 为共培养20d 后，脂肪干细胞的表面标记表达流式检测结果。

通过分析可以看到，不同脂肪干细胞与脂肪细胞共培养比例下，共培养组B(共培养比例为1:1)和共培养组C(共培养比例为2:1)的流式结果，与相应的控制对照组B 和组C 相比，CD105 的表达发生下降(b,f,d,h)，CD105 表达分别是，共培养组B 为4.8%，对照组B 为12.4%;共培养组C 为1.3%，对照组C 为6.8%。而另外一个间充质细胞的特异性表面标记CD44，(a,c,e,g)，共培养组B 中为2.9%，对照组B 中为3.1%，没有显着变化;在另一共培养组C 中为0.9%，对照组C 中为5.4%，发生显着变化。

通过以上分析发现(f,g)，经过共培养的脂肪干细胞，其表面抗原CD105的表达发生明显的降低，其结果接近不表达。CD105作为间充质细胞特异表达的表面抗原发生这一改变意味着，脂肪干细胞在共培养过程中可能发生了一定程度上的分化。

3 结 论

采用人体吸脂来源的干细胞与脂肪细胞进行共培养，8d 之内不能促使脂肪干细胞成脂分化。且将共培养时间延长至20d 后，仍未能观察到脂肪干细胞发生明显的成脂分化现象。通过流式细胞仪对共培养的脂肪干细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析，发现共培养后脂肪干细胞与非共培养对照组相比较，其中间充质细胞特异性表达标记CD105 发生明显降低，这就意味着本实验的共培养过程中，脂肪干细胞内部已发生一定程度的改变。