外泌体u6内参基因ct值（内参基因ct值25）

本文目录一览：

• 1、被控12项欺诈罪，或面临20年徒刑？硅谷“女版乔布斯”受审在即
• 2、上海的生命银行国际集团公司大家了解多少
• 3、qRT-PCR 计算公式2–ΔΔCT (Livak) 方法
• 4、最近在做microRNA的荧光定量PCR，用U6做内参，想请教一下，U6的Ct值在什么范围内，目的基因表达呈线性关系

被控12项欺诈罪，或面临20年徒刑？硅谷“女版乔布斯”受审在即

实习生丨 林昀肖、刘荷月

编辑丨 李欣夷

9月原本是秋天收获的季节，但对“女版乔布斯”、美国血液检测公司Theranos的创始人伊丽莎白·福尔摩斯来说，是寒冬提前到来。

近日，媒体报道称， 福尔摩斯将接受审判，为此前自己设的“骗局”让投资者损失超过7亿美元买单。 9月2日，该消息冲上热搜榜。

据了解，2018年3月，福尔摩斯和公司Theranos被美国证券交易委员会（SEC）指控欺诈，面临高达12项的欺诈罪名。如果被判有罪，福尔摩斯将面临最高20年的监禁。

其实，通过血液进行癌症检测，是一种液体活检技术。液体活检是指通过采集人的血液、积液、尿液、唾液等体液样本，检测生物标志物、进行肿瘤分析的诊断技术。该技术取样过程方便快速，对人体侵入性较低，依从性良好，具有无创和高效等优点。

近年来，我国每年新发癌症病例超过350万，死亡病例超过200万，防控形势严峻。 液体活检技术使癌症早期阶段的筛查成为可能。 “早筛的意义，在于能够大幅提升治愈率，并大幅降低医疗成本，提升患者的生活质量。”中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会主任委员、复旦大学附属肿瘤医院副院长叶定伟在接受媒体采访时表示。

滴血测癌骗局

2014年，硅谷明星生物 科技 公司Theranos耗资近600亿元的“血液检测”神话曾经轰动全美。该公司声称发明了一种突破性的创新技术， 通过指尖采集一两滴血液就能完成专业实验室才能完成的超过240种测试， 范围从胆固醇囊括到癌症检测。

在鼎盛时期，Theranos的估值一度达到90亿美元（接近600亿人民币），福尔摩斯也在2014年登上福布斯杂志封面，其大胆言论和黑色高领毛衣让媒体纷纷将其称为“女版史蒂夫-乔布斯”。

但2015年10月，有媒体揭露Theranos的“滴血测癌”为惊天骗局。 该公司系购买西门子公司仪器进行检测，并将检测结果冒充成自己的检测结果。 紧随其后的调查结果也显示，其所发明的检测机器“爱迪生”漏洞百出， 相关技术根本无法支撑“滴血测癌”的美好愿望。

2018年3月，福尔摩斯和公司Theranos被美国证券交易委员会（SEC）指控欺诈，面临高达12项的欺诈罪名。如果被判有罪，福尔摩斯将面临最高20年的监禁。检察官表示，她在测试方面故意误导患者，并向投资者夸大公司业绩。

Theranos公司也于2018年倒闭。据最新消息， 福尔摩斯的开庭陈述将于2021年9月8日举行，审判预计将持续13周。

与之形成鲜明对比的是，2016年1月，美国第一家用表观技术来查癌症的Grail公司甫一成立并即受到热捧，谷歌和比尔·盖茨都参与投资。上述企业负责人指出，Grail能够开发相应技术，是因为在学术上有了明确的方法论，表观遗传学可以用做肿瘤筛查已通过许多科学家研究和实验的证明，在生物学领域得到公认。而福尔摩斯的所谓“滴血测癌”从来没有解释清楚其科学原理，也没有得到专业人士的认可。

“科学家的认知不是由媒体和公众评价决定，而是由学术成果来定的。没有学术积累，即使是商业天才也不可能做出创新，这是对科学的不尊重。”上述企业负责人表示。

血液能测癌吗？

实际上，美国血液检测公司Theranos和创始人伊丽莎白·福尔摩斯被指控， 并不意味着血液检测不能测癌，而是滴血测癌这个概念本身不够科学。

那血液检测筛查早期癌症的原理为何？

通俗来讲，人体是由无数细胞所组成，所有细胞都会向血液内释放DNA和蛋白质，包括变异的癌细胞。而癌细胞蕴含的DNA和蛋白质变异在进入血液后，可以通过血液检查发现，从而识别早期癌症。

如复旦大学研究员陈兴栋团队研究发现，对于结直肠癌、食管癌、肝癌、肺癌和胃癌5种常见恶性肿瘤，早期的癌症信号——微量肿瘤甲基化就存在于血液循环之中，可以无创检测出来。

此外，该团队还发现 癌症信号在病症发展早期、甚至在无症状未确诊的若干年前，就会存在于血液中。 利用泰州前瞻性队列的样本，复旦研究团队在严格意义上证明DNA甲基化测序能够比传统诊断方法更早发现癌症。

鹍远基因研究人员基于ctDNA甲基化特质设计了一套机器学习方法PanSeer ，在训练集中的特异性为94.7%，对确诊后采集的病人样本以及确诊前采集样本的敏感性分别达到88%和91%。在一个独立的测试样本集中，该研究团队在207个 健康 对照样本重现96%特异性的前提下， 在113个确诊后采集的病人样本上达到了88%的敏感性。 此外，在98名确诊前1-4年采集的样本中也达到了95%的检测敏感性。

上述研究共同通讯作者、鹍远基因公司联合创始人兼首席技术官刘蕊博士认为，该研究在技术上的最大突破，是利用半靶向PCR技术构建血浆游离DNA靶向测序文库的方法，大幅度提高甲基化靶点的富集效率，解决了早期癌症患者血浆中ctDNA稀少、常规方法DNA丢失率高、检测灵敏度受限等问题。

陈兴栋表示，目前国外一些类似多癌早期筛查研究的检测方法成本很高。此项研究证实， 仅需从单管血液中取样少量DNA即可检测， 具备作为潜在一线癌症早筛手段的有效性和经济性。

实为液体活检

通过血液进行癌症检测，属于一种液体活检技术。液体活检即通过采集人的血液、积液、尿液、唾液等体液样本，检测生物标志物、进行肿瘤分析的诊断技术。液体活检的工作流程包括采集样本、物流运输、样本检测和检测报告。

尽管组织活检是肿瘤诊断的金标准，可做形态学和分子评估，但研究表明，由于肿瘤内和同一患者肿瘤间均具有异质性，所以组织活检不能捕捉一个患者的全部肿瘤负荷的基因组学全貌；另外，组织活检还存在侵入性较大、可能提供不了足够样本用于病理检测、不适用于动态监测、有些肿瘤位置不合适穿刺等缺点。

液体活检技术具有无创和高效的优点。 液体活检取样过程方便快速，对人体的侵入性较低，依从性良好。同时其检测过程操作简单，对医疗资源的依赖性较低，样本可及性高，方便进行多次取样。检测周期通常在1-2 周。

但液体活检技术也有捕获能力差、检出率低、个体化差异大等方面的问题，其技术还在进一步完善中。

据头豹研究院分析，液体活检技术主要有三种分析物。 第一种是循环肿瘤细胞（CTCs）的检测。 这是自发或因诊疗操作从实体瘤病灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞。由于其携带大量与肿瘤产生、转移以及耐药机制相关信息，可用于监测肿瘤动态与临床治疗效果，也可用于检测药物敏感性。

目前，CTC检测技术在判断转移性结直肠癌、乳腺癌及前列腺癌患者预后等方面的临床应用价值已得到证实。

第二种是循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测。 ctDNA指由肿瘤细胞释放到人体血液系统中的循环DNA片段，来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞、CTC及肿瘤细胞外泌体，含有肿瘤基因组所特有的基因突变，可用于检测微小残留病灶和隐匿性转移病灶及监测肿瘤治疗效果，也可用于分析肿瘤细胞突变、扩增、缺失等遗传信息的变化。ctDNA检测可在临床症状出现前检出肿瘤，具有辅助早期诊断的应用潜能。

第三种是外泌体检测。 外泌体是肿瘤细胞脱落的囊泡，在血液、唾液、尿液等多种体液中均有分布。外泌体通常大量产生、释放，并在外部脂质膜的保护下维持囊泡成分稳定，其携带的定量信息可预测恶性肿瘤是否存在。

目前，在液体活检早筛市场上， 燃石医学、泛生子 等初创生物技术公司都进行了广泛布局。近期美国基因测序巨头因美纳（Illumina）拟80亿美元收购的癌症筛查初创公司 Grail 也在开发液体活检技术，希望能够对卵巢癌等癌症进行早期筛查。

市场潜力巨大

据了解，我国每年新发癌症病例超过350万，死亡病例超过200万，防控形势严峻。近年来，肺癌、乳腺癌及结直肠癌等发病呈显著上升趋势，肝癌、胃癌及食管癌等发病率仍居高不下。

以肝癌为例，据西南证券研究报告，在不考虑市场渗透率的情况下， 我国肝癌早筛早诊市场空间高达2000亿元。 液体活检技术使得癌症早期阶段的筛查成为可能，无论是肿瘤诊断，治疗还是监控领域，液体活检的优势都使其成为最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段，具有极高的临床应用价值和市场前景。

“早筛的意义在于能够大幅提升治愈率，大幅降低医疗成本，提升患者的生活质量。”中国抗癌协会泌尿男生殖系肿瘤专业委员会主任委员、复旦大学附属肿瘤医院副院长叶定伟在接受媒体采访时表示。

资本市场对液体活检的早筛技术热情高涨。据不完全统计，今年上半年， 全球液体活检行业发生15起主要融资项目，融资总额超6.4亿美元。 另据Evaluate Medtech数据，整个2020年融资排名前十的公司中，有一半都是液体活检领域初创企业。

上半年融资的15家液体活检公司中，公开融资轮次有14家。从融资轮次来看，主要集中在A轮，共6家。其次是B轮和C轮，分别为3家。未来这一市场还有着较大的成长空间。

据了解，目前 华大基因、迪安诊断、贝瑞基因、美康生物 等十余家上市公司将肿瘤早筛以及液体活检纳入其业务范畴。美国 Exact Sciences 公司的早期肝细胞癌（HCC）血液检产品在2019年获得FDA授予的突破性医疗器械认定；而 Grail、广州燃石 等在泛癌种液体活检早筛上也正在积极研发。国内也有多个研究机构在此领域开展研究，目前多家生物 科技 企业积极入局癌症早筛早诊领域，并进行产品转化。

国家层面也高度重视肿瘤早筛。《“ 健康 中国2030”规划纲要》指出，要强化慢性病筛查和早期发现，针对高发地区重点癌症开展早诊早治工作，推动癌症脑卒中冠心病等慢性病的机会性筛查，并提出到2030年要实现全人群全生命周期的慢性病 健康 管理，总体癌症5年生存率提高15%。受政策和市场双重推崇的影响，肿瘤早筛早诊已成为国内和国际研究的热门领域。

华安证券预测，尽管目前仍处于发展的早期阶段，随着技术的不断突破和国家政策的大力支持，我国基于液体活检的肿瘤早筛市场预计在2030年达到千亿规模。

上海的生命银行国际集团公司大家了解多少

你说的“上海的生命银行国际集团公司”是不是我所了解的：

上海嘉定区新冠路的深处，藏着一座鲜为人知的“生命银行”——中国干细胞集团。这里有多个全国之最——全国最大规模的干细胞公共资源库，年移植例数和总移植例数最多……从它里面走出的每一颗“生命种子”——脐带血造血干细胞，都深深地牵动着人心。如今，这座全国最大的“生命银行”与上海科创中心“共振”，搭建一座领先的“干细胞精准医疗服务平台”，成为全国干细胞精准医疗的“领头羊”。

生命种子救命

每一天，人的干细胞都在分化，若不幸某一类干细胞出现问题，如造血干细胞，就会出现血液系统疾病。原先白血病常被看作是绝症；如今，中国干细胞集团里-200℃的液氮罐中，储藏着一颗颗“生命种子”，饱含生的希望。

中国干细胞集团脱胎于上海市脐带血造血干细胞库，2004年成立之初，每年临床移植都是个位数，现已与全国83家有移植资质的医院合作。截至目前，“生命银行”已向全国各地的2100多名血液病患者提供了移植用脐带血造血干细胞，全球华人患者在集团干细胞库的配型成功率已达到100%。

“相比骨髓移植，脐带血采集对产妇和新生儿无影响，非亲属间适合的机会大，排斥反应少。而且，脐带血库是实体库很难悔捐，调用起来更方便。”中国干细胞集团总经理王磊告诉记者，除了救命，干细胞可帮助人体器官和身体健康“返老还童”。

抗衰减龄有道

干细胞家族中有个重要成员——间充质干细胞，正在被全球干细胞前沿技术密切关注。它来源于发育早期的中胚层和外胚层，属多能细胞。在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、肌肉、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。犹如一个个“种子细胞”，它能修复衰老和病变引起的组织器官损伤，为人体抗衰，帮器官减龄。

目前，中国干细胞集团在脐血造血干细胞制备、检测、保存等技术成熟的基础上，专注间充质干细胞，以及脐血造血干细胞体外扩增等国际前沿技术。例如，在研的外泌体产品，是由间充质干细胞分泌的携带一系列ctDNA、microRNA的“微胶囊”，这类“微胶囊”可有效修复人体受损的心肌细胞，在治疗心肌损伤等心脏疾病方面有广阔的应用前景。而脐血源间充质干细胞的有效扩增技术，间充质干细胞的免疫调节技术等，有望最大程度地将脐血、胎盘、脐带等医疗废弃物“变废为宝”。

今年6月，中国干细胞集团获得上海市科委支持，展开干细胞科技创新的技术研发布局，着力于干细胞关键技术的开发应用与推广，主要包括干细胞定向分化及细胞转分化机制。同时，建立干细胞大规模培养关键技术体系，探讨移植细胞与组织环境相互作用，免疫耐受与免疫调节机制，明确移植细胞的作用机制等。

配套技术支持

我国干细胞产业从上游的存储到下游临床应用正在形成完整的产业链，未来5年产业收入有望从目前的20亿元增长到300亿元。合法的干细胞来源，干细胞先进技术应用，以及行业发展的有效规范，是我国干细胞产业稳步发展的关键。为此，中国干细胞集团正在布局和完善上中下游的干细胞产业链。

在上海建设具有全球影响力科创中心的过程中，拥有我国最大干细胞公共库的中国干细胞集团，也有自己的“科创梦”——充分发挥“生命银行”的独特优势，进一步建立“干细胞精准医疗服务平台”，为全国患者和干细胞研发提供安全有效的干细胞输注资源，精准的干细胞临床移植服务。

“与此同时，平台将为我国干细胞高新技术中小企业、干细胞研究、干细胞研发等提供一条龙式的干细胞共性技术支持，引领和推动我国干细胞精准医疗事业的蓬勃快速发展。

qRT-PCR 计算公式2–ΔΔCT (Livak) 方法

当我们做到荧光定量实验时候，普遍采用操作简便的2–ΔΔCT 法。

前提条件：

1. 使用2–ΔΔCT 法之前，必须验证目标基因和参照基因的扩增效率。目标基因和参照基因扩增效率都接近100%， 且相互间效率偏差在5% 以内。

计算方法：

首先，对所有的测试样和校准样本，用内参基因的CT 值归一目标基因的CT 值：

ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)

ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)

其次，用校准样本的ΔCT 值归一试验样本的ΔCT 值：

ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)

最后，计算表达水平比率：

2–ΔΔCT = 表达量的比值

计算模板建立

而现在我们现在用的这款仪器QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System是无法计算的，所以需要自己手动计算，理解原理更容易操作。当然，此公式适合于所有2–ΔΔCT 法的荧光定量。

经我修改后计算模板：

Quantitative PCR calculation template for QuantStudio(TM) 7 Flex System_J.F.XIE(均值法) .xls

Extract code：hybr

案例展示

以吉玛生物公司试剂说明书案例为例，来计算 microRNA 相对于 U6 snRNA 的表达比率。

运用计算模板，只需对应输入数据，即可自动计算出公式，结果如下：

1. 数据修正：三个重复，如果CT值差异在0.2以外，则应剔除掉，所得结果均值会更加好。

2. 数据录入：我们在做PCR时候，已经排好版面，所以再挑出这些基因及内参时候，需要花费精力。简单点，可以将结果复制粘贴到新的excle文档，然后“筛选”，依次筛选出不同模板的“内参”、“靶标基因”的CT值，如下图筛选出的是EGFP对照处理组内参rpl32的CT值。

3. 对应：做定量时候，同一模板做基因，又检测内参，所以关系是 一一对应 ，所以在录入时候，一定要对应准确，每个孔都有Well Position，结合着384孔板来看，强烈建议在做排版设计之初，就做到 简洁、对称、明了 ，便于后续分析。

如果在下机前，有部分孔扩增有问题，如双曲线，不要“剔除”，可以直接将其记录下来或者清空这个孔的CT（不是改为0），因为一旦“omit”之后，我们后续筛选时候，导致 数据不对称 ，会比较麻烦，容易出错。

4. 计算表达值时候，会有一个生物重复做归一化，即2的0次方为1，案例中的calibrator。这个自己可以选，我习惯将排版的最开始的那一个做归一。

如果你想将所有表达基因，都可以展示在一张图片上，那所有值应该都与这个归一化值做比较。

可以看到，Well Position是比较整齐的，依次为GHIIJK，当筛选基因时候，也会一一对应，不会出错。

最近在做microRNA的荧光定量PCR，用U6做内参，想请教一下，U6的Ct值在什么范围内，目的基因表达呈线性关系

我最近也要做mi RNA的荧光定量PCR，用U6做内参，但是苦于没有找到U6的基因序列（NCBI里面有好多种，不晓得哪一个是），宝生物那边以前有现成的U6引物，但现在不生产了，说只能自己提供基因序列，他们设计和合成，哎！想问一下楼主你的U6引物在哪个公司设计和合成的呀？需要提供基因序列么？是人的还是小鼠或其他物种的U6？如果方便的话，可否提供一下小鼠的U6基因序列呢?多谢！