外泌体pkh26肿瘤细胞摄取实验步骤的简单介绍

本文目录一览：

• 1、Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移
• 2、外泌体提取策略
• 3、microRNA与血管通透性转移研究套路

Hepatology：M2型巨噬细胞来源外泌体通过αMβ2 整合素促进肝癌转移

前言

肝细胞癌（HCC）是世界上第五大常见癌症，以及全球癌症死亡的第五大原因。大部分HCC患者出现转移，其中肺转移的总体生存率约5.9月，无转移患者总体生存率约16.2月。肺转移在恶性肿瘤中的发病率约25%-30%，HCC患者发病率约41.6%-43.6%。

肿瘤细胞与相应微环境的相互作用以及基质细胞参与肿瘤进展的重要性。肿瘤的基质细胞有内皮细胞，纤维母细胞，肿瘤浸润的炎症细胞，这些细胞创造微环境，改善肿瘤细胞的特性，调控肿瘤的发展及对治疗的应答。研究表明，肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）可以加速肿瘤的发生、发展。巨噬细胞根据极化特性分为M1和M2型，M1型巨噬细胞能够分泌促炎症和免疫刺激因子，TAMs比较接近M2型巨噬细胞，可以激活产生Th2细胞因子。TAMs加速癌细胞转移以及癌细胞与TAMs对话的潜在机制有待进一步阐明。

外泌体是一种包含蛋白、核酸、脂质的微小囊泡，参与肿瘤微环境中不同类型细胞间的物质运输、信息传递。由于TAMs外泌体与肿瘤的研究是有限的，所以TAMs外泌体对肿瘤的发生发展和转移也需要进一步探索。

最近发表于Hepatology杂志（IF=14.679）的研究指出，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来源的外泌体介导CD11b/CD18蛋白转移到肿瘤细胞，可能增强了肝癌细胞迁移能力，为肿瘤转移机制提供新的见解。

◆ 技术路线 ◆

在这项研究中，研究人员获取120例肝癌vs. 癌旁，转移vs. 非转移临床样本，CD206、CD68在肝癌和HCC非转移组织样本中表达显著升高，且CD206、CD68高表达患者预后较差。

功能上，M2型巨噬细胞/M2型巨噬细胞条件培养基与肝癌细胞共培养，促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

PKH26染色示踪肝癌细胞吞噬外泌体效率；M2型巨噬细胞来源外泌体（M1 exos）介导肝癌细胞迁移和侵袭；GW4869（外泌体抑制剂）逆转迁移和侵袭表型。

体内实验表明，巨噬细胞来源外泌体预处理肝癌细胞，尾静脉接种到小鼠。与对照、M1 exos相比，M2 exos组肺转移显著增强；GW4869可以逆转体内肺转移表型。另外，M2 exos组总体生存时间也显著降低。M2 exos增强HCC细胞侵袭能力，可能是巨噬细胞和肝癌细胞之间的一种新的信息传递模型。

蛋白质组学测序：M2 exos 组显著上调的蛋白有：FGL2，FABP4, CD37, ITGB2 (CD18 or β2 integrin), ITGB5, and ITGAM (CD11b or αM integrin)。体内和体外研究结果表明，CD18 、CD11b在M2 exo中高表达，可通过M2 exo传递到HCC细胞；CD18 、CD11b抗体阻断后迁移和侵袭能力也下调，小鼠存活时间延长。

前期研究结果表明，在肿瘤发生的初期，MMPs降解胞外基质介导肿瘤的侵袭和转移。研究者通过WB、qPCR、ELISA实验发现M2 exo处理的肝癌细胞中MMP-9表达上调，CD18 、CD11b抗体阻断后MMP-9表达量下调；MMP抑制剂（MMPi）或联合M2 exo处理肝癌细胞，其迁移和侵袭力下降；另外MMPi处理的肝癌细胞接种小鼠，肺转移数目显著降低。

总之，本研究阐明了M2 exo传递αMβ2到肝癌细胞，激活受体细胞表达MMP9，从而促进肝癌转移。

● HYY提供外泌体研究的整体实验服务 ●

                                               —  如有相关需要，欢迎扫码咨询  —

外泌体提取策略

外泌体即细胞外囊泡（简称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡

2 外泌体的提取纯化方法

2.1 基于密度的分离方法

2.1.1 超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度离心法

目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡

2.2 沉淀法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡

2.2.2 试剂盒法

最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡

2.3 基于大小的分离方法

2.3.1 SEC SEC

主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡

2.3.2超滤法

超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡

2.4 基于表面成分亲和力的分离法

2.4.1 蛋白质

外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡

2.4.2 膜磷脂

虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡

2.5   ACE分离法

ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡

2.6 微流控芯片法

微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡

提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。 

microRNA与血管通透性转移研究套路

Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis，if=27.407  Cancer Cell.  2014 Apr 14;25(4):501-15. doi: 10.1016/j.ccr.2014.03.00

microRNA可以被肿瘤细胞以外泌体的形式分泌出来，可以与周边的细胞进行crosstalk，进而起到远程调控的作用。可进行crosstalk的周边细胞种类包括：肿瘤微环境中纤维细胞、血管内皮细胞、同类肿瘤细胞等等。本文题目来看，是肿瘤分泌mir-105，作用于远处血管内皮细胞，调节血管内皮细胞屏障功能，而血管内皮屏障作用是肿瘤转移的一个步骤。两个基本内容mir105调节靶基因和肿瘤转移都是很基础的概念，为何能发表于cancer cell这种27分的杂志上呢？

首先利用研究exosome的方法，证实肿瘤细胞可以分泌exosome，利用检测方法检测exosome内mir-105表达量增高。exosome的研究方法包括：提取分离的方法、电镜观察法、exosome表面特定标志物western检测；microRNA的pcr检测方法。然后验证外泌体内miR-105的生物学功能，需要将肿瘤细胞与血管内皮细胞共培养，观察血管内皮细胞的连接方式变化；制作乳腺癌动物模型，观察肿瘤转移数目和取血管内皮细胞观察连接方式改变；检测乳腺癌患者血清内miR-105表达水平，观察转移评价指标（DFS）。最后对miR-105调节的靶基因进行验证，靶基因通过网站筛选、双荧光素酶实验验证，验证的靶基因具有调节血管内皮细胞连接方式的生物学功能；可以行靶基因的rescue实验，证实miR-105调节的充要条件。

首先观察转移性肿瘤细胞和非转移性肿瘤细胞分泌的exosome功能学差异。转移性乳腺癌细胞 MDA-MB-231、乳腺上皮细胞MCF-10A。超速离心法分离exosome，电镜下观察。因为主要证明其与血管内皮细胞的关系，所以通过荧光染色验证人类微血管内皮细胞（HMVECs）可以摄取肿瘤细胞分泌的exosome。荧光电镜和流式细胞仪两种方法检测证实。transwell检测接受exosome后的HMVECs迁移功能的变化。结果显示：转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome，可以被HMVECs摄取，进而影响内皮细胞的迁移功能。那么exosome中哪种成分才是调节迁移的主要分子呢？

通过Solexa深度测序的方法检测转移性exosome和非转移性exosome中microRNA的表达差异，发现基本相同，也列表显示出差异microRNA表。但是最终还是选择了mir-105，而且据说还靶向TJP1：tight junction protein 1紧密连接蛋白（OZ1）。没有交代选择miR-105的标准，一般选差异最明显，作者只是说：we further focused on mir-105。之后选取数十种乳腺癌细胞系，有的是原发肿瘤细胞系，有的是乳腺癌胸腔积液分离出来的转移性细胞系。分别检测的原发瘤细胞和转移细胞系细胞内和exosome中miR-105的表达水平，发现不论是细胞内还是exosome中，在转移性细胞系中miR-105都高表达，提示miR-105是乳腺癌转移特异相关。

进一步验证转移性乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的exosome可以将miR-105转入内皮细胞。分别将MDA-MB-231和MCF-10A分泌的exosome与HMVECs共培养，分别利用PKH67和Cy3标记exosome和miR-105，荧光显微镜下观察不同染色的定位情况。最终证实MDA-MB-231分泌的exosome中miR-105可以转移至HMVECs中，而不是exosome刺激HMVECs产生大量miR-105.

前期的exosome分泌、转移内容证实之后，下面就对miR-105影响内皮细胞的功能进行深入研究，或者说miR-105调节的靶基因和生物学功能深入研究。我会先做一些生物学功能实验：干扰内皮细胞miR-105表达水平，观察迁移侵袭的变化；如果HMVECs培养能形成微血管，甚至可以观察微血管内皮细胞间距的变化。然后荧光素酶验证靶基因。

首先双荧光素酶实验，验证miR-105可以靶向抑制TJP1基因，之后再在内皮细胞水平，转染miR-105之后，观察内皮细胞OZ-1 mRNA和蛋白的表达抑制。该实验干预内皮细胞内mir -105表达方法，不是使用siRNA或者miR-up等合成化合物，而是直接使用MDA-MB-231分泌的exosome，以及其他各种对照（MCF-10A），还涉及了rescue实验。总之证实了miR-105可以靶向抑制内皮细胞ZO-1蛋白的表达。以下内容为更专业的研究内皮细胞连接的方法。

1、培养基中内皮细胞连接成片，细胞间有细胞连接体。通过免疫染色ZO-1、OOccludin和E-caderin等细胞连接体，后免疫荧光电镜观察这些连接体的表达变化情况。

2、HMVECs细胞间通透性检测，permeablity assay：了解内皮屏障变化的直接效果，利用transwell小室，内皮细胞培养形成平铺一层内皮细胞膜，上层加罗丹明染料颗粒，后可以利用exosome调节内皮细胞的连接松紧程度，观察转入下层的罗丹明颗粒数量。甚至可以测量内皮细胞通透性阻抗electrical Resistance。除了观察罗丹明，还可以GFP标记MDA-MB-231癌细胞，观察癌细胞迁移数目的变化。

3、3D vascular sprout assay，3D培养内皮细胞，形成微血管树，然后给予exosome后，观察测量微血管树的变化，评估exosome对微血管的影响。

除了阐述miR-105的上述生物学功能，更重要的是证实ZO-1是介导miR-105生物学功能的充要条件，需要设计rescue实验，证明恢复ZO-1后，可以逆转miR-105的生物学功能改变。这部分内容不需要单独列出，在阐述mi-105的功能学变化过程中，多加入一组rescue组别即可，因为最终检测的biomarker都是一样的。

以下内容为动物模型水平，验证miR-105的生物学功能。

动物选取NOD/SCID/IL2Rγ null mice，用miR-105含量不同的exosome注射尾静脉处理干预，（exosome from MCF10A/vec (low-miR-105), MCF-10A/miR-105 (high-miR-105), or MDA-MB-231 cells (high-miR-105), or PBS as control）。 动物模型如何评估血管通透性和肿瘤转移性。

动物模型静脉注射染料罗丹明，观察肿瘤常见转移器官肺和脑组织中罗丹明渗透情况，如果肺或脑组织中罗丹明染料增多，提示血管通透性增加。

动物模型，评估肿瘤转移性，最常见的指标是转移瘤数目或大小。而本文则将移植瘤细胞首先利用荧光标记，然后在心内注射形成移植瘤，3周之后，提取肺和脑组织中荧光基因的表达量，表达量越高提示转移瘤负荷越大。

当然，肝肺组织病理切片，含量不同miR-105处理干预之后，免疫荧光染色观察OZ-1及occludin等细胞连接蛋白表达情况也可间接说明问题。（CD31染色提示血管结构，观察血管结构内OZ-1连接蛋白表达降低）。

之前都是利用mir-105含量不同的exosome做干预，观察血管通透性和转移瘤负荷。那么原发瘤中miR-105高表达后，是否能起到同样的作用呢？首先制作高表达miR-105的移植瘤模型，选取 an MCF-10A-derived tumorigenic line, MCFDCIS, which forms lesions similar to comedo ductal carcinoma in situ that spontaneously progress to invasive tumors为细胞模型，检测细胞miR-105表达含量、细胞内ZO-1表达水平，以及细胞的迁移和转移属性，证实模型成功。之后同上一部分，检测罗丹明染料评估血管通透性、检测荧光基因评估转移瘤负荷，以及病理切片ZO-1染色。结果证实原发瘤高表达miR-105，同样可以抑制肺脑组织ZO-1表达、增加血管内皮通透性、促进肿瘤转移。

为了证实，miR-105抑制剂能否逆转上述生物学功能变化，具有治疗意义。动物模型制备同上一部分，干预处理措施为：尾静脉注射anti-mir-105，检测指标同上。结果显示anti--miR-105具有治疗意义。

检测瘤组织和血清mir-105表达水平，是否具有一致性，以及miR-105与ZO-1具有负相关，回顾性分析转移瘤和未转移瘤患者血清miR-105表达水平，高表达者发生转移率更高。或者生存分析预后。

microRNA研究套路：细胞生物学功能、靶基因验证及介导功能的必要性、动物模型试验，最后在临床病例寻找证据，支持机制研究结论。这是基础研究的逻辑方式，首先在分子机制研究透彻了，然后找临床数据支持。而临床研究逻辑则相反：首先发现有临床现象和临床数据支持，然后在深入探讨细胞和动物水平有没有该现象，如果有的话，最后深入探讨分子基因互作机制。另外研究血管通透性相关转移，可以参考该文的实验方法。•

参考资料：

NOD/SCID/IL2γ null mouse：

 NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。

• Prkdcscid ：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T和B细胞缺失 ，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。

• Il2rgnull： Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子Il2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。

B- NSG 小鼠 ：综合了NOD-SCID-IL2rg背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。

优点

• 迄今世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠；

• 与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年；

• 对人源细胞和组织几乎没有排斥反应；

• 少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型；