肿瘤微环境免疫细胞数（肿瘤微环境中的免疫细胞）

本文目录一览：

• 1、熟悉的肿瘤免疫微环境分析，深入探究乳腺癌亚型的免疫差异
• 2、肿瘤微环境简述
• 3、2022-03-07 肿瘤免疫微环境

熟悉的肿瘤免疫微环境分析，深入探究乳腺癌亚型的免疫差异

An independent poor-prognosis subtype of breast cancer defined by a distinct tumor immune microenvironment

一种由独特的肿瘤免疫微环境定义的独立贫血亚型乳腺癌

发表期刊：Nat Commun

发表日期：2019 Dec 3

影响因子：12.121

DOI:  10.1038/s41467-019-13329-5

一、研究背景

肿瘤微环境影响癌症的起始和进展。在乳腺癌中，临床病理特征，如年龄，等级，阶段和分子亚型与预后有关，并驱动治疗决策。5种临床相关的分子亚型：Luminal A、Luminal B、Her2富集型、基底样型和正常样型，其发病率、生存率、预后和肿瘤生物学特性各不相同。

除了癌细胞生物学因素外，炎症微环境也影响着肿瘤的起始和进展。癌细胞周围的免疫微环境可以识别和抑制肿瘤生长或促进进展。在乳腺癌中，高免疫浸润已与更好的临床结果。此外，高免疫浸润已与新辅助和辅助化疗的反应增加相关。

二、材料与方法

  1   数据来源

1）基因表达：手术收集的MicMa队列（其中的子集用于分析， MicMa-nCounter（n = 96，FFPE），MicMa-Agilent（n=104，新鲜冷冻组织））

2）RNA-seq：OSLO2-EMIT0队列（GSE135298，原始数据在EGAS00001003631）

3）公开的数据：表达数据从GEO、European Genome-phenome Archive、ArrayExpress或TCGA获得；METABRIC队列

  2   分析流程

1）基因集富集分析

2）无监督聚类获得免疫簇：基于509个基因，使用R包pheatmap对患者的相关性矩阵进行层次聚类

3）Nanodissect：用于淋巴和髓细胞浸润的预测，淋巴细胞或骨髓细胞浸润的nanodissect分数反映了样本中各自基因的平均表达量

4）CIBERSORT（22种类型的浸润性免疫细胞的绝对比例）、ssGSEA（上皮间质转化、干细胞、增殖和细胞周期相关途径的基因集）

5）二项式逻辑回归预测免疫集群：R包glmnet （构建模型公式）

6）免疫浸润的病理评估

7）ROR评分：ROR-Score=0.05×Basal+0.12×Her2-enriched − 0.34×Luminal A+0.23×Luminal B；其中，基底、Her2富集、管腔A和管腔B是每个样本与R中使用genefu软件包获得的质心的相关性

8）统计学、生存分析、多变量Cox回归分析

三、结果展示

01 - 乳腺癌的免疫簇并反映了逐渐的免疫浸润

测量了MicMa队列的95个肿瘤样本中760个基因的表达，该阵列旨在剖析实体肿瘤中的免疫浸润。这95个样本中的79个样本之前已经通过Agilent全基因组4×44K寡核阵列进行了剖析。首先使用Pearson和Spearman相关性比较了两个平台获得的表达，发现基因的表达值之间存在高度的正相关（补充图1A）。

为了根据免疫相关基因表达的相似性对患者进行分组，对相关矩阵进行了无监督的分层聚类（图1a和补充图1B）。从3到10个聚类的轮廓图分析表明，3个聚类最好地捕获了nCounter和Agilent数据集的分割（补充图1C，D）。比较了两个数据集MicMa-nCounter和MicMa-Agilent的聚类结果。在这两个数据集中，有79个样本是重叠的。随着用于测量基因表达的不同平台，以及基因列表和用于执行无监督聚类的样本的不完全重叠，仍然发现79个重叠样本的聚类分配显著相似。

为了确认集群与肿瘤免疫微环境相关（图1b），使用算法Nanodissect为总淋巴细胞和骨髓细胞浸润打分。Nanodissect评分首先在MicMa队列中使用有经验的病理学家分析的匹配苏木精和曙红切片的免疫浸润评估进行验证（图1c和补充图1E）。发现这三个簇与Nanodissect淋巴细胞（图1b）和骨髓细胞（补充图1F）评分显著相关。得出结论，簇A-C反映了逐渐的免疫浸润，因此被称为免疫簇。

使用其他9个队列的表达数据验证了这些簇与淋巴/髓细胞浸润之间的关联。有509个基因在所有研究的数据集中被发现，被用于无监督聚类（图1d和补充图2A，分别用于METABRIC和TCGA队列的聚类）。在每个队列中，所得到的三个聚类与淋巴和骨髓Nanodissect评分显著相关（图1e；补充图2B）。淋巴和髓细胞浸润从簇A（蓝色；低浸润；冷肿瘤）逐渐增加到簇B（浅蓝色；中等浸润）和簇C（粉红色；高浸润；热肿瘤）。

对于额外的一层验证，使用METABRIC队列中免疫浸润的病理评估，这与Nanodissect评分（图1f和补充图2C）和免疫簇显著相关。使用PanCancer免疫剖析阵列的基因进行无监督分层聚类，可以根据免疫浸润的渐进水平对乳腺癌肿瘤进行分组。

02 - 免疫簇与预后相关

对于两个最大的队列METABRIC(n = 1904)和TCGA(n = 981)，发现簇B(具有中等水平的免疫浸润)与更差的预后相关(补充图3A，B)。当分别对ER阴性（补充图3C，D）和ER阳性（补充图3E，F）的病例进行分层时，也观察到簇B病例的这种更差的结果。为了完善观察结果，根据簇B（浅蓝色）与簇A和簇C（紫色）绘制了患者生存期图，并证实簇B患者的预后明显且显著恶化（图2）。用相关生存数据在另外四个队列中进一步验证了这一结果。结论是免疫簇与ER阴性和ER阳性乳腺癌的预后相关。

03 - 用二项式逻辑回归预测免疫簇

基于免疫聚类的临床相关性，旨在开发一种通用的方法，能够准确而敏感地预测患者的预后较差的分类，而不必依赖于无监督聚类。作者使用二项式逻辑回归，通过lasso进行惩罚，得到一组基因，这些基因可以敏感和特异地预测一个样本是否属于簇B，通过接收者操作特征曲线和曲线下面积（AUC）分析评估（图3a）。96.3%的样本被模型预测为簇A和簇C，而68.8%的样本分到了簇B（图3b）。

通过比较生存期对数秩检验p值，发现lasso分类普遍改善了免疫簇与生存期之间的显著关联。lasso模型在另外5个队列中得到了验证。图3c-e为STAM(n = 856)、MAINZ(n= 200)和UPSA(n = 289)，补充图5A、B为CAL(n = 118)和PNC(n= 92)。

由于二项式逻辑回归只预测了两个簇（簇B与簇A和簇C），进行了另一轮二项式逻辑回归，以高准确度区分簇A和簇C（补充图5C，D）。

04 - 免疫簇，一个独立的预后因素

作者进一步研究了免疫簇与乳腺癌中著名的临床病理特征（大小、年龄、等级、阶段、淋巴结受累和分子亚型（PAM50））的关系。簇A（免疫浸润度低）富含ER阳性和Luminal病例，而簇C（免疫浸润度高）中ER阴性和Basal样病例比例较高，ER阴性和ER阳性样本以及PAM50亚型在预后不良的簇B中同样占有一定比例（图4a，b）。

使用多变量Cox回归分析测试了免疫簇的预后影响，同时考虑了其他预后因素。发现免疫簇是模型生存的重要因素，如每个队列Cox模型中与免疫群相关的显著p值所示。为了进一步检验免疫簇作为重要的预后生物标志物的优势，采用了逐步回溯选择的方法。对于所有队列，免疫簇被保留在最佳拟合的最小模型中，在11个队列中的9个队列中，免疫簇是一个显著的预后变量。

05 - 具有复发风险（ROR）评分的新RNA-seq数据集的验证

EMIT0，这是OSLO2队列研究的一个子集，OSLO2-EMIT0由食品和药物管理局批准的Prosigna复发风险（ROR）分数评估，ROR评分在标准的临床病理特征之上增加了重要的预后信息。发现簇B组成的样本与簇A和C相比具有中间的ROR评分（图4c），表明与簇B相关的不良预后不可能由ROR评分中包含的信息来解释。当分别评估ER阴性（补充图7A）和ER阳性（补充图7B）病例时有同样结果。对于所有队列通过已有方法计算ROR评分，该方法与PAM50亚型有关，并证实簇B由中间ROR评分组成（图4d和补充图7C，D）。

多变量回归分析证实，免疫簇为ROR评分带来了额外的预后价值，这体现在用ROR评分和免疫簇建立生存模型时，免疫簇的p值显著。通过计算净重分类改善（NRI）和综合判别改善（IDI）指数，强调了免疫簇与ROR评分一起使用时，根据生存率对患者进行分类的额外价值，正如所有队列中NRI和IDI系数为正值所示。NRI和IDI的置信区间（CI）构建的Bootstrapping显示，对于几个队列，免疫簇与ROR评分相加时，显著改善了患者根据预后的分类。

06 - 免疫簇和对新辅助化疗的反应

进一步评估了免疫簇与新辅助化疗反应之间的关系，使用了来自8项研究（1377个样本）的基因表达数据，并使用lasso将每个样本分配给其所属的免疫簇。如图4e，发现簇C应答者百分比最高，其次是簇A，簇B应答者百分比最低。还计算了每个组中应答者的百分比：簇C平均有42%的应答者和58%的残余疾病患者，而簇B有18%/82%的应答者和13%/87%的残余疾病患者。由于pCR率作为ER状态的函数不同，还独立计算了ER阳性和ER阴性病例的应答者比例，发现无论ER状态如何，簇B的应答者比例最低（分别为补充图8A、B）。

对于每个对新辅助化疗有反应的队列，评估了pCR和非pCR病例在各免疫群中的分布。当考虑整个队列时，发现应答者在各免疫群组的分布有显著不同，簇B的应答者较少，簇C组的应答者居多；当按ER状态拆分时，虽然并非总是显著，但也观察到同样的趋势。这些结果表明，簇C中的患者有更高的概率成为应答者。研究结果还突出了簇B的低响应率，表明这类患者可能是新的新辅助治疗方案测试的候选人。

07 - 免疫簇的计算机剖析

为了评估集群中的逐渐免疫浸润是否可以解释与预后的关联，在Cox多变量回归分析中测试了免疫集群或总免疫浸润评分中哪一个对生存更有预测性。作者假设特定的免疫细胞类型混合物，而不是肿瘤微环境中的免疫细胞总数，可能是簇B预后差的原因。

使用CIBERSORT算法估计22种不同的免疫细胞类型的比例，对这种细胞类型特异性中位数浸润分数进行无监督聚类（图5a）。簇C病例中，富集了巨噬细胞M1、记忆激活T细胞和滤泡T辅助细胞（图5a），METABRIC和TCGA队列中CIBERSORT评分的分布也说明了这一点（图5b）。簇A如预期的那样，免疫细胞的水平非常低。在反应和预后较差的簇B中，发现巨噬细胞M2、静止肥大细胞和静止记忆T细胞的水平较高（图5a，图5b）。

使用广义线性模型，指定了区分簇B与簇A-C的免疫细胞类型（图5c）。还测试了哪些免疫细胞类型解释了簇A与簇B之间的差异和簇B与簇C之间的差异。

08 - 免疫簇的表型分析

通过差异基因表达分析确定了簇B中显著过度表达的基因，与簇A和簇C相比，簇B中有909个基因分别上调。这些基因与干细胞生物学和EMT相关，如使用MsigDB31的H和C2集合的基因集富集分析（GSEA）所示（图6a）。

为了进一步描述免疫簇与癌细胞表型之间的关系，使用了与EMT、干细胞、缺氧和增殖相关的基因集。使用GSVA方法计算了每个集群和队列的平均基因集富集分数，该分数反映了免疫集群中每个路径/基因集的活动。平均基因集分数的无监督聚类将免疫簇A和C分开，而簇B被分为两个亚组（图6b）。这些结果表明免疫簇与干细胞/EMT相关基因特征之间存在关联。

通过GSVA富集分数的无监督聚类，确定了乳腺癌中两个相互排斥的基因特征：（i）一个与增殖和胚胎干细胞样表型相关，（ii）另一个与EMT和乳腺干细胞表型相关。增殖表型在簇C中占主导地位（补充图11A），当计算每个代谢样品的基因集得分时也观察到了同样的情况（补充图11B）。在簇B中，EMT或增殖相关特征的平均基因集得分较高（补充图11C）。在代谢物组的样品水平上，我们观察到一个或另一个状态被激活的样品的类似模式（补充图11D）。簇A显示EMT和增殖状态得分较低（补充图11E，F）。

为了正式确定哪些基因集分数解释簇B，使用广义线性模型测试每个基因集的贡献程度。EMT标志对簇B有积极贡献，而增殖和细胞运动性与簇A和C相关（图6c）。还测试了当单独与簇A或簇C比较时，哪种基因集得分可以解释簇B。

09 - 肿瘤表型与免疫浸润的相关性

由于免疫簇与（i）免疫细胞类型和（ii）基因集特征相关，评估了免疫浸润（CIBERSORT）和癌细胞特征（基因集分数）之间的关系。图6d显示增殖和EMT分数与不同类型的免疫细胞显著相关。高EMT分数与巨噬细胞M2、静息肥大细胞和静息记忆T细胞相关，而高增殖与更活跃的适应性肿瘤微环境相关。这些数据表明癌细胞表型和肿瘤微环境的组成之间存在连续性。

簇B以致瘤免疫浸润为主，EMT信号高，但约35%的簇B也表现为增殖表型。为了探索簇B中的这种异质性，以无监督的方式根据基因特征分数将样本分组为B1以EMT表型为主，B2以增殖为主（图6e）。

在METABRIC和TCGA中，具有增殖表型的B2病例的预后较差（图6f，g）。为了进一步评估基因集评分的异质性是否伴随着免疫环境的异质性，作者寻求B1和B2亚群之间特异性免疫细胞类型的差异。补充图14中的无监督聚类显示，两个子聚类B1和B2都具有促肿瘤/静息免疫微环境。总而言之，簇B中两种相互排斥的状态可能与预后有关；然而，簇B的一个统一因素是存在促肿瘤/静息免疫微环境。

四、结论

在本研究中，发现了与临床相关的免疫簇与渐进性免疫浸润。在15个乳腺癌队列中，跨越6101个乳腺癌样本，肿瘤免疫浸润中等水平的患者群预后较差，与已知的预后分子和临床病理学特征无关。通过对群组免疫成分的表征，发现亲肿瘤免疫浸润与不良预后组相关。进一步的表型分析显示乳腺癌中存在两种相互排斥的侵袭性肿瘤表型，一种与EMT有关，另一种与增殖有关。这两种表型都是在不活跃/促肿瘤免疫微环境上发现的不良预后群。

肿瘤微环境简述

1 、肿瘤微环境定义

       肿瘤微环境（Tumor micro-environment, TME）是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质（ECM）。

2 、肿瘤微环境特点

在实体肿瘤中，由于肿瘤组织迅速增长，提及高度膨胀及肿瘤组织内部血管系统不完备，这些会导致肿瘤组织内氧气供应不足，肿瘤微环境呈现出整体缺氧的特点。

由于氧气供给不足，肿瘤细胞只能够通过无氧酵解的方式进行能量代谢，这会造成乳酸的积累；与此同时，肿瘤细胞膜上的离子交换蛋白也在源源不断的将细胞内部H+运输到细胞外，避免造成自身酸中毒。这些细胞反应也在不同程度上造成肿瘤微环境PH降低，整体呈现酸性环境。

  在肿瘤发生发展及缺氧，酸性的微环境下，肿瘤组织及外围组织细胞会发生大量凋亡，释放细胞碎片及趋化因子，导致炎症细胞浸润及炎症因子分泌。与此同时，肿瘤本身的发生发展也会引发免疫系统的免疫反应，造成炎症细胞在该区域聚集，引发剧烈的炎症反应。

3、肿瘤微环境作用

 虽然肿瘤微环境具有不同于正常组织的恶劣环境，但是肿瘤微环境依旧在肿瘤发生发展中具有促进作用。肿瘤与肿瘤微环境通常被称为种子与土壤的关系。肿瘤与肿瘤微环境密切相关，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。

4、肿瘤微环境在科研研究中的应用

4.1 、肿瘤相关成纤维细胞研究方式汇总

  4.2 、肿瘤相关成纤维细胞

        肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是肿瘤组织中被癌细胞激活的成纤维细胞，具有成肌纤维细胞的特性。CAFs表型恶性转换与肿瘤演进密切相关，同时CAFs是肿瘤微环境的主要组织成分。

      在常见的科研论文研究中，研究人员一般研究肿瘤相关成纤维细胞分泌物及细胞间通讯对肿瘤细胞增殖，迁移以及凋亡方面的影响。这类研究一般与外泌体相关方面联合起来进行分析研究。

4.3 、肿瘤相关巨噬细胞类群分化

      肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages, TAMs）是浸润在肿瘤组织中的巨噬细胞，是肿瘤微环境中最多的免疫细胞。研究表明M1型巨噬细胞主要起到抑制肿瘤，促进炎症及免疫活性方面的作用，而M2型巨噬细胞则起到组织修复，免疫逃逸及促进肿瘤发生发展的作用。巨噬细胞在肿瘤微环境中数目比例与肿瘤发生发展，严重程度及预后具有高度相关性。

  在常见的科研论文中，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤微环境中研究方向很多。归纳起来主要为某些基因/药物调控巨噬细胞分化水平，并将其应用于肿瘤发生机制研究及肿瘤治疗探讨。

4.4 、肿瘤相关 T 细胞类群分化

 T细胞作为细胞免疫的主体类群，在肿瘤免疫细胞杀伤中具有重要作用。而在肿瘤微环境中，T细胞中CD8阳性T亚型可以对肿瘤细胞造成杀伤作用，而CD8阳性T细胞主要通过CD4阳性T细胞中Treg细胞进行调节。

在肿瘤微环境的研究中，研究人员将CD4+FOXP3+T细胞在各类肿瘤中数目比例变化作为肿瘤微环境中T细胞免疫活性的标杆。而在常见的研究中，主要研究基因或药物在T细胞分化及肿瘤发生发展中T细胞比例变化方面对肿瘤机制及肿瘤治疗进行探讨分析。

5、总结

肿瘤微环境是肿瘤细胞与周围组织，免疫细胞相互作用而形成的一个复杂的综合系统。肿瘤微环境的存在提升肿瘤细胞增殖，迁移能力及免疫逃逸能力，进而促进肿瘤的发生发展。而随着肿瘤微环境研究的日益发展，更高效的肿瘤治疗方式及药物也会在不久的将来问世。

2022-03-07 肿瘤免疫微环境

肿瘤微环境是一种非常复杂且动态的生态系统，是肿瘤赖以生存的“土壤”。

主要参与者包括： 肿瘤细胞，免疫细胞和支持细胞（如成纤维细胞）

在肿瘤细胞、成纤维细胞或炎症细胞的趋化因子的吸引作用下，血液循环系统中的免疫细胞通过跨内皮过程迁移到肿瘤部位，在肿瘤组织内，免疫细胞局部增殖、分化、发挥功能、死亡，部分迁移回循环系统。

在这些细胞群中，人们经常可以找到与急性炎症相关的细胞（包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞）、 先天免疫相关的细胞（包括巨噬细胞、NK 细胞和 DC）以及来自适应性免疫反应的细胞（包括CD8+ T 细胞、Th1-/Th2细胞和 B 细胞） 。

肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 是一个数量相对丰富的细胞亚群，在许多肿瘤中，它们的数量是超过其他类型免疫细胞的。

TAM具有高度可塑性的表型和功能，目前已经确定的有两种主要亚型： M1型TAM (由Toll样受体配体[如脂多糖和干扰素-γ]诱导)，优先表达促炎细胞因子和诱导型一氧化氮合酶； M2型TAM (由IL-4或IL-13诱导)，表达精氨酸酶1、CD206、CD163、IL-4R、TGF-β1和血小板衍生生长因子(PDGF)。一些研究结果表明，M1型TAM可增强抗肿瘤 Th1 反应并拮抗调节性免疫细胞的抑制活性，而M2型TAM则主要发挥促进血管生成、肿瘤生长和转移的功能。

NK细胞

NK细胞是先天免疫系统中的细胞毒性效应淋巴细胞，其主要功能是帮助控制感染和肿瘤。NK细胞识别肿瘤细胞的两个主要机制是：它们可以识别MHC-I类分子表达下调的细胞（在多种癌症类型中均表现出的一种免疫耐受现象），或与肿瘤细胞上表达的应激诱导配体结合(如MICA或MICB，它们可与NK细胞上表达的NKG2D结合)。

树突状细胞

树突状细胞 (DC) 的主要功能是在先天性和适应性免疫反应之间起到桥梁作用。在生理环境下，DC 吞噬并处理非自身抗原，当它们接收到危险或激活信号时，会被激活并移动到淋巴结的次级淋巴结构，在那里激活初始 B 或 T 细胞。DC 的表型具有相当的可塑性，它们可以产生多种的促炎或免疫抑制细胞因子，以及表达一系列的激活或抑制性的受体，这取决于它们所在的环境。次级淋巴器官是受保护的环境，在此环境中可产生能够有效激活适应性免疫反应的 DC 。

三级淋巴结构

TLS是在炎症病理状态下发展起来的高度组织化的淋巴集合体。在癌症中，TLS通常发生在肿瘤的浸润边缘和/或间质中，类似于其他慢性感染性或自身免疫性疾病。

CD4+ CD8+ T细胞

CD4+ T 辅助细胞分为不同的亚型，包括 Th1、Th2、Th17、Tfh 和 Treg；每个亚群在抗肿瘤免疫反应中都发挥着特定的作用。总体而言，以 Th1 为导向的反应会抑制肿瘤生长，并且通常与良好的临床结果相关。事实上，Th1细胞可通过产生包括 IL-2 和 IFN-γ 在内的几种细胞因子，在原位增强细胞毒性 T 细胞的抗肿瘤功能。Tfh细胞与 TLS 中的 B 细胞相互作用以帮助产生抗体。

其他肿瘤浸润CD4+ T细胞亚群(Th2、Th17和Treg)的作用尚不是很清楚，但在不同的肿瘤中常与预后不良相关。许多研究表明， 肿瘤中的Treg通过两种主要机制抑制抗肿瘤免疫反应 :

(1)产生抑制性细胞因子(如IL-10、TGF-β、IL-35)；

(2)抑制DC的发育成熟。

CD8+ T 细胞在抗肿瘤免疫反应中发挥着非常重要的作用，因为它们负责识别和消除肿瘤细胞。由于基因组的不稳定性，肿瘤细胞通常在其表面表达突变蛋白。其中许多是诱导肿瘤特异性免疫反应的新抗原。活化的 CD8+ T 细胞负责肿瘤细胞的识别和裂解，其机制在文献中有详细描述，其中包括释放细胞毒性颗粒。有趣的是，在大多数肿瘤中，浸润性细胞毒性 T 细胞表达抑制性受体（例如 PD-1、Tim-3 和 Lag-3 ），其在生理情况下的功能是与其配体结合时抑制免疫反应。事实上，许多肿瘤细胞可以利用这种抑制机制，并表达多种配体（例如 PD-L1、PD-L2），帮助它们逃避 T 细胞的攻击。

B淋巴细胞

在肿瘤以及其他一些炎症条件下，B 细胞通过产生抗体、刺激性细胞因子和趋化因子来增强 T 细胞反应，充当局部抗原呈递细胞，并组织形成维持免疫反应的TLS。B细胞可以发挥所有的这些功能，并且总体上具有抗肿瘤作用。此外，最近的证据表明，它们还可以通过产生 IL-10 等细胞因子发挥免疫调节作用。