细胞培养操作（细胞培养操作台）

本文目录一览：

• 1、细胞培养一般方法有哪些
• 2、细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
• 3、细胞培养的具体步骤

细胞培养一般方法有哪些

细胞培养首先分为原代培养和传代培养.

一、原代培养需要从组织中消化、分离、纯化出单细胞,然后继续进行传代、冻存；

二、传代培养首先进行细胞复苏:

1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-38度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.

2.在无菌台内将完全培养基加入培养瓶内,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养瓶内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养,24h后换液；也可复苏当时离心（1000rpm 5min左右）后,完全培养基重悬培养,适时换液.

细胞传代:

1.贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死细胞,50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后收集离心（1000rpm 5min左右）,新鲜培养基重悬沉淀,加入完全培养基后继续培养或实验.

2.悬浮细胞:

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度或需更换新培养基,可先离心（1000rpm,5min左右）后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

具体步骤：

一、细胞复苏

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。

加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

二、细胞传代

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

三、细胞冻存

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要求：

1．无菌环境

无毒和无菌是体外培养细胞的首要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。

3.适宜的渗透压

高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱、肿胀、破裂。因此，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。多数体外培养的细胞对渗透压都有一定的耐受能力，实际应用中，260～320mmol/L的渗透压可适用于大多数细胞。

4．气体环境与pH

细胞的体外培养需要理想的气体环境，氧气、二氧化碳是细胞生存的必要条件。氧气参与细胞的三羧酸循环，为细胞生存、代谢与合成提供能量；二氧化碳既是细胞的代谢产物，是细胞生长的必需成分，又与维持培养液的pH有关。大多数细胞适宜的pH范围往往是7.2～7.4。

注意事项：

（1）第一次开始培养某种细胞时，一定要在WWW. ATCC. ORG上用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂、通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。

（2）进入细胞间开始细胞培养时，必须严格按照步骤操作。

（3）预防细胞污染

（4）防止细胞交叉污染

扩展资料：

动物细胞培养：

在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。

⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。

⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。

⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。

参考资料：细胞培养-百度百科

细胞培养的具体步骤

一、复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后(大概1-1.5分钟)，拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中(用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来)，1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5.根据细胞增长速度2-3天换一次培养基。

二、传代

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶(能覆盖细胞就行)，消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，让细胞悬浮起来。

6.把细胞吸到10ml或15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、冻存

把细胞消化下来并离心(同上)。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。