外泌体裂解液比例（外泌体裂解液比例是多少）

本文目录一览：

• 1、红细胞裂解液的原理是什么
• 2、Western blot实验需要准备什么试剂和耗材
• 3、提rna步骤及原理结果分析

红细胞裂解液的原理是什么

去除红细胞最简便易行的方法之一是用裂解液裂解红细胞，它既不损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。裂解液裂解是一种比较温和的红细胞去除方法,主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化，淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞，可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。

保存条件

2-8℃保存。

使用说明

组织细胞样品：

1.新鲜组织经胰酶或胶原酶等消化分散成单个细胞悬液，离心弃去上清液；

2.从4℃冰箱中取出ELS裂解液，按1:3-5的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入3-5ml裂解液），轻轻吹打混匀；

3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；

4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；

5.如裂解不完全可重复步骤2和3；

6.重悬细胞，用于后续实验；如提取RNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液中进行。

血细胞：

1.新鲜抗凝血，离心弃去上清液；

2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液，按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液），轻轻吹打混匀；

3.800-1000rpm离心5-8分钟，离心弃去上层红色清液；

4.收集沉淀部分，加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次；

5.如裂解不完全可重复步骤2和3；

6.重悬细胞，用于后续实验；如提取RNA，最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行。

Western blot实验需要准备什么试剂和耗材

1.1细胞

①将细胞培养皿置于冰上，用冰冷得PBS洗涤细胞2次

②吸出PBS，加入裂解液（碧云天P0013；1%TritonX-100；）

a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

b.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。（一般10*7个细胞用100ul裂解后获得的上清蛋白浓度约为2-4mg/ml）

③用刮刀刮下贴壁细胞，转移至EP管，14000rpm离心5分钟

④将上清液转移至EP管，负20℃保存

1.2组织

①将组织样品剪成细小碎片（最好在冰上进行）

②加入裂解液

a.融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。

c.按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

d.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。如果组织样品本身细小，可适当剪切后直接加入裂解液，通过强烈涡旋使样品裂解充分

（每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清，其蛋白浓度约为15-25mg/ml，不同状态的不同组织有所不同）

③充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清

2. 蛋白定量（Thermo UF289356)

2.1稀释白蛋白(BSA)标准液的制备

2.2 制备BCA工作液（A液：B液=50：1 密闭室温可以保存一段时间）

总体积=（#标准孔+#未知孔）*#复孔*每个样本的体积

测试管每管2ml;96孔板每孔200ul。

2.3 浓度测定

①将25ul标准液和样本设置复孔加入96孔板，按照样本：BCA工作液（1：8）加入200ul BCA工作液(如果样本有限就加10ul比例用1：20；推荐每个待测的样本做2-3个平行反应；根据样品的浓度，可提前稀释5-10倍)

②最好摇匀30秒，将96孔板在37℃孵育30min

③冷却至室温，酶标仪设置为562nm，在5分钟内测试完所有的样本。

④所有的样本减去空白对照在562nm处的吸光度，绘制标准曲线，确定样本的浓度

3. 蛋白电泳

3.1 变性以及还原蛋白

在蛋白样品中加入含SDS（保证样品中的所有蛋白带电荷一致）的上样缓冲液，100℃加热煮沸。

3.1.1室温溶解蛋白上样缓冲液（5×），按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合。

3.1.2 100℃或沸水浴加热10分钟，以充分变性蛋白

3.1.3 冰上骤冷，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔即可

3.1.4通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近则可以停止电泳

4. SDS-PAGE凝胶电泳

4.1 胶的选择与制备（根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶的浓度）

4.2 配胶（碧云天P0012AC）

洗干净玻璃板，装板加水验漏后，晾干装到制胶架上。根据配方配胶。

（配胶顺序：先配分离胶（下层胶），充分凝固后，再配浓缩胶（上层胶））

4.2.2 配制浓缩胶（上层胶）

4.2.3 组装制胶器

①将制备好的分离胶灌入制胶板内（缓慢不要有气泡），随后缓慢加入适量异丙醇压平分离胶。

②20-30分钟分离胶凝聚完成，倾斜板，倒掉异丙醇，吸水纸吸去残余液体，弃去上层压胶的水或醇。

③加入配好的浓缩胶灌入制胶板内，然后插上梳子，20-30分钟浓缩胶即可凝聚。

④缓慢取出梳子，上样。

4.2.4 上样及电泳

①蛋白冰上溶解，调整蛋白浓度，和等体积5×上样缓冲液混合，即为上样液。用纯水冲洗胶板，放入电泳槽

②两块板之间倒入电泳液，确认无漏液

③迅速拔出梳子，用枪轻轻吹孔使碎片冲出

④依次加入蛋白marker和蛋白样品，每孔加上样液20ug，留一孔加预染的marker.加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用70V恒压电泳，约30min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用90V恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。（上样时间尽量短，避免样品扩散，但也不能过快避免样品溢出而造成相邻加样孔的交叉污染，未加样的孔中加入等量的样品缓冲液）

⑤调节电泳的电压和时间，传统胶是上层胶80V，30min;下层胶120V 90-120min.

(为了防止蛋白条带再凝胶上扩散，电泳后应尽快转膜)

5. 转膜

将蛋白凝胶中的蛋白，通过电流作用转移到转印膜上。由于蛋白凝胶本身易碎，蛋白条带容易子啊凝胶中扩散，而且抗体也不易于进入凝胶中与目的蛋白结合，所以需要在转印膜这样的固相载体上实现后续封闭、洗涤，显色等实验操作。

5.1 转膜

①将减好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上，然后用dd H2O漂洗2min,浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作

②装配转膜三明治结构（在转移缓冲液中制备三明治可以避免气泡的产生）

黑面（负极）→海绵垫→3层滤纸→凝胶→转印膜→3层滤纸→海绵垫→红面（正极），每层之间不能有气泡。然后将三明治转移至电泳槽中，黑面对黑面。

提rna步骤及原理结果分析

1、RNA抽提原理

简单地讲，RNA抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的RNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使RNA与裂解体系中的其它成分，如DNA、蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。Trizol试剂的出现基本能解决绝大部分样品RNA抽提，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流。

2、了解你的实验样品

如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的RNA，以下的信息一定要先行收集：该样品的RNA含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提RNA的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择抽提方法。但同时提醒的是：没有信息是可怕的，更可怕的是将错误的信息当真的了。

3、实验样品量的取用

样品与Trizol的比例。这个问题非常重要，应该获得足够的重视。Trizol的Protocol，提供了一个简单的比例，1ml裂解液可以用于50-100mg组织或5-10X106个细胞；我的建议是，样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的RNA，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为1ml裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果 (纯度及得率) 没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。不同得样品其RNA含量差别很大。