免疫细胞冻存最佳密度（免疫细胞冻存的功能）

本文目录一览：

• 1、细胞培养之新手必看
• 2、请问主细胞库和工作细胞库的细胞代次不得超过多少代？还有它的冻存密度要多少？ 有急用！！！谢谢了~~
• 3、细胞冻在-80冻和液氮冻的区别
• 4、求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤
• 5、细胞的冷冻和储存

细胞培养之新手必看

细胞培养技术是细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的基础实验技术之一。通过细胞培养可以直接观察活细胞的形态结构和生命活动，联合各种技术进行各种物理、化学生物的研究。

一、准备工作

细胞培养的准备工作是很重要，也很复杂的一项工作，应予以重视。

1.无菌室及无菌操作台

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%

ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar

flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。

2.实验材料的准备

2.1玻璃器皿的清洗、干燥、消毒：

1）细胞培养的和主要是玻璃容器与pasteur pipet，其它均为塑料无菌制品。

2）实验用的玻璃容器与pasteur pipet使用前都要进行清洗。新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。

3）用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

4）实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。

2.2培养容器：种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。

2.3 培养基的配制及分装

1）细胞培养基通常须添加10%血清，液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

2）粉末培养基(以1升为例)之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。高压灭菌后添加血清。

3）为避免培养基污染，可以在培养基中添加双抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若实验或细胞不允许，可将培养基少量分装。操作均在无菌条件下进行。

2.4 抗生素

1）ATCC细胞库之细胞培养基不加抗生素

2）培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze前培养基须添加抗生素，待token freeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。

3）寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。

4）若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。

5）去除细菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml,streptomycin 250ug/ml,neomycin 250ug/ml,bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。

6）抗生素使用种类与浓度：

2.5血清

1）血清必须贮存于–20～–70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。

2）一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3）瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

3.培养箱及其他仪器的检查与调试

1）CO2钢瓶之CO2压力。

2）CO2培养箱之CO2浓度(5%)、温度(37度)、及更换水盘的无菌水(可添加消毒剂(Zephrin 1:750)每周更换。

3）无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。

4. 其他试剂的配制及灭菌

4.1 PBS(PH7.4，1L)：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可0.01M。高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，置于4度或常温保存。

4.2 无菌水：双蒸水高压蒸汽灭菌121℃,15 lb,20分钟，室温放冷，常温保存。

二、细胞传代培养

工作人员穿戴实验衣及手套进入无菌室，小心取用实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class

II)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。

细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。具体步骤：

粘附细胞：

1. 吸掉旧培养液。

2. 用PBS洗涤细胞一至二次。

3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液)。

4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

悬浮细胞：

1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

三、细胞冷冻保存

步骤：

1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。

3. 按细胞传代培养操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液((约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vapor phase长期储存。

6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于含异丙醇的程序降温盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。

注意事项：

1. 欲冷冻保存的细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80–90％致密度。

2. 冷冻前检测细胞仍保有其特有性质。

3.冷冻保护剂DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以5~10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

4. 冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

四、细胞复苏

步骤：

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3. 离心，1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

注意事项：

1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

3 将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

五、细胞计数与存活测试

1.存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。

2. 步骤：

2.1. 取50µl细胞悬浮液与50µl trypan blue (or Erythrosin bluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

2.2. 取少许混合液(约15µl)自细胞计数版上方凹槽加入，于100倍倒立显微镜下观察，或于细胞计数仪中自动检测活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosinbluish)。

2.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

4 大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml

请问主细胞库和工作细胞库的细胞代次不得超过多少代？还有它的冻存密度要多少？ 有急用！！！谢谢了~~

细胞分好几种，一般常用VERO细胞，正常工作传代代次不得超过150代，因此可以按你需要确定主代细胞及工作细胞代次，一般主代135代，工作代139代，可以更低。一般冻存密度5000000~10000000个细胞/ml，每2ml冻存管加1.5ml

细胞冻在-80冻和液氮冻的区别

一般认为现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，而这些技术的发展几乎都离不开细胞培养技术，特别是医药领域的发展，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用，而细胞冻存又是细胞培养不可或缺的一步。

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术，它一般包括复苏、传代及冻存，这里增添了驯化的步骤，主要是为了得到我们需要的目标细胞，如将贴壁细胞驯化为可悬浮培养的悬浮细胞等。

通常情况下细胞实验周期较长，所以总免不了要冻存一部分细胞以备后用，那我就来说下冻存时的操作步骤和注意细节:

细胞冻存

1、为什么要进行细胞冻存？

细胞培养过程会出现污染或者有些细胞经长期传代培养后可能被诱导分化，而这时之前冻存的细胞就是重新来过的“火种”，避免全军覆没的危险；同时细胞冻存还能节省实验室空间、经费及时间成本；最重要的是确保实验的一致性和连贯性。

2、保护剂的分类？

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞外形成冰晶会因为脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱；如细胞内冰晶形成较多会造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。

图 有无细胞外冰晶形成（左：有；右：无）

因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。在细胞冻存的过程中用来保护细胞而添加的保护剂一般分为渗透型如甘油、二甲基亚砜（DMSO）或甲醇等，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内冰晶的形成，从而减少对细胞的损伤。另一种是非渗透型的保护剂剂，一般是些大分子物质，主要包括聚乙.烯吡.咯烷酮（PVP）、蔗糖等，可保护细胞免受伤害，提高细胞活率。

3、细胞冻存要什么？

超低温冰箱或液氮罐

0.25%胰蛋白酶

20%以上血清的完全培养液或血清

DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒)

专用细胞冻存管，程序降温盒

吸管、离心管、喷灯、冻存管架

4、细胞冻存怎么做？

图 细胞冻存

细胞收集

贴壁细胞：选择处于对数生长期的细胞，将培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。去掉胰蛋白酶后加入适量培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液后离心。

悬浮细胞：直接将细胞收集到离心管后离心

保护剂添加

去上清，加入含20%以上小牛血清的完全培养基或血清，于4℃预冷15分钟后，加入10%的DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装于细胞冻存管，细胞浓度为3×10^6～1×10^7cells/ml之间。将装有细胞悬液的冻存管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记。

细胞冻存

细胞冻存一般是慢冻：先将冻存管置入置于4℃ 30-40 min，再转入-20℃ 2h后，再放入-80℃冰箱冷冻过夜后保存到液氮罐中。

图 Genever冻存管及程序降温盒

目前更多使用程序降温盒，将细胞冻存管放于盒内，直接置于超低温冰箱，程序降温盒可控制每分钟下降1℃。

1.拧开冻存盒；2.抽出支架；3.加入异丙醇；4.支架放回冻存盒中；5.放入冻存管；6.拧好盖子放入-80℃冰箱保存4h。

05、渗透型保护剂的配置

冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

无血清细胞冻存液如Corning KM Banker II，属于即用型细胞液可直接冻存于-80℃冰箱而无需程序性降温。无血清细胞冻存液不含血清，只含DMSO、葡萄糖等营养成份，大大降低了动物血清来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险，且冻存液成分和配比明确，批次间差异很小，能够保证生长细胞状态的稳定性，细胞存活率高。

求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤

贴壁细胞冻存实验准备：

将15mL离心管、冻存管、PBS缓冲液、移液管、电动移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒灭菌；

细胞完全培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、细胞冻存液等从4℃冰箱中取出后，复温至室温，备用；程序降温盒复温至室温备用。

贴壁细胞冻存操作步骤：

1. 从培养箱中取出准备冻存的细胞；

2. 显微镜下观察细胞状态并拍照记录；

3. 酒精消毒培养瓶后放入安全柜中；

4. 吸去多余的培养基，加人2~3ml PBS缓冲液润洗一次；

5. 加入1ml胰酶，放入37℃消化；

6. 消化1min左右，在显微镜下观察细胞消化情况；

7. 消化完全后，加3ml完全培养基终止；

8. 将细胞悬液移入15ml离心管中离心，1000rpm/min（约200g）离心3-5min；

9. 吸去多余的液体，向细胞沉淀中加入适量的冻存液，轻轻吸打混匀；

10. 按比例分装至冻存管中；

11. 贴好标签后放入梯度冻存盒中；

12. 将冻存盒放入-80℃，降温过夜后，移入液氮中保存。

注意事项：

1）细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；

2）不同细胞消化时间有差异，以实际镜检结果为准，大部分细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可中止消化，消化时间不宜过长；

3）应选择汇合度80%-90%左右，细胞处于对数生长期时进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；

4）冻存细胞保存温度应低于-130℃，不可在-80℃长期保存。

细胞的冷冻和储存

细胞生长时的表型会发生改变或漂变，所以细胞必须计数，计数后应马上冻存。

冷冻细胞前

1 检查冷冻细胞所需试剂和器具是否备齐。

2 确认有无菌的可用于冷冻的冻存管 。

3 确认液氮罐里是否有冻存细胞的位置。

冷冻细胞

1 将培养基中的细胞培养至对数生长期。

2 进行活细胞计数，不要冻存死细胞比例高达20％以上的细胞。

3 决定冻存量，安排需要几个冻存管。

冻存细胞在融化时要稀释10 倍，而稀释后的液体是5X种子液。

例如：如果种子液的密度为5.0 X 105 个／ ml, 那么融化后重新悬浮细胞时细胞的密度为2. 5 X 106 个／ ml, 所以冻存细胞时的细胞密度为2.5 X 107 个／ ml 。

1 准备好冷冻培养基， 分装成1 ml, 冻存培养基通常包括一般培养基、10%~20%血清、5%~10％的甘油或二甲基亚砜。如果你不清楚用什么，那么就使用20％的血清和10％的二甲基亚砜。

2 在冷冻培养基中用移液管小心吹打粒状沉淀。

3 每个冻存管中分装1 ml 冻存培养基，放置在冰上操作。

4 把冻存管放入冻存盒中，做好标记，放入-60C 或更低温度的冰箱，放置16~24 小时。

5 倒些液氮至冰盒内，把细胞从冰箱转移到液氮罐之间要把细胞放在这样的冰盒内。如果没有现成的液氮，可以把细胞放在干冰上。

6 将细胞放置在合适的位置，立即做好记录。

液氮的使用

1 细胞常常保存在液氮罐或是液氮制冷柜中，但是要每隔几个星期补充液氮

2 自动填充液氮的罐子，必须定期检查，以保证管道的畅通以及液氮罐没有空掉。

3 在操作液氮罐内容器时要戴好厚手套，否则会冻伤手臂。

4 从液氮罐内拿出细胞时至少也应戴上乳胶手套

5 不要在液氮罐内悬吊物品，也不要吸入气化后的液氮，用手挥开液氮后，就能看见液面了。

6 戴好保护眼睛的眼罩，以免操作冻存管时，冻存管爆炸溅伤眼睛。

7 决不能把没有拧紧的管子放入液氮中，而且要提前找负责液氮罐管理的人员确定位置，不要乱放。

8 不要关闭警报，定期检查。

9 如果听到了液氮罐的报警声，立即通知实验室管理人员。如果是周末或凌晨，则先检查确认是否是由于液氮面过低或温度过高引起的报警，再联系负责液氮罐的人员。