外泌体课题设计（外泌体研究策略）

本文目录一览：

• 1、六年级语文《种瓜得豆》课文
• 2、调控相关——lncRNA（学习总结）
• 3、蛋白的表达与纯化
• 4、为什么说细胞间也有用来传递免疫信号的快递？

六年级语文《种瓜得豆》课文

学习会使你获得许多你成长所必需的“能源”,学习会给你带来更多的希望,学习会让你拥有更多的“资本”。但同时,学习也使你付出许多,其中包括你的努力、你的钻研、你的时光、你的心血和汗水等。下面是我精心整理的六年级语文《种瓜得豆》课文，希望对你有帮助!

《种瓜得豆》

俗话说：“种瓜得瓜，种豆得豆。”的确，瓜是瓜，豆是豆，种瓜怎么可能收获豆子呢?然而，现代的转基因技术却能做到“种瓜得豆”。

什么是转基因技术呢?

人们发现，在生物的每一个细胞里都有许多基因。这些基因是每种植物或动物的“大管家”，有的管叶子长得圆还是扁，有的管脚长得长还是短……当然，植物结瓜还是结豆，也是由基因来“发号施令”的。

科学家已经摸清了一些生物体内的基因的本领，他们把一种生物里的某种基因“搬”到另一种生物里。这样，只要“搬到新家”的“大管家”“住得惯”，发挥自己的本领，就会创造出某种前所未有的新生物。这种让基因“搬家”的技术，就叫转基因技术。当然，如果“搬到新家”的基因“水土不服”，“住不惯”，或者原有“住户”不认它，把它“赶”出去，那么，这项转基因技术就算失败了。

如果把豆子里管结什么果的'基因“搬”到瓜里，完全可能做到“种瓜得豆”。不过，也许让瓜结出豆并没有什么太大的意义，因此，恐怕也不会有科学家做这件事。

但是，转基因技术在农业生产上却大有用武之地。

有一种叫棉铃虫的昆虫，它是棉花的头号“灾星”。而有一种细菌可以分泌(mì)一种杀死棉铃虫的物质，是棉铃虫的“克星”。我国科学家把这种细菌里管生产这种物质的基因“搬”到棉花里，这样棉花也会产生可以杀死棉铃虫的物质。棉铃虫吃了棉花的叶子，自然也就没命了。这种不怕棉铃虫的转基因棉花受到了农民的欢迎。

美国科学家把牵牛花里的蓝色基因“搬”到玫瑰(méigui)花中，结果培育出了开蓝色花的玫瑰。这种玫瑰使爱花的人们乐不可支。

此外，科学家还培育出了可杀死杂草的转基因大豆、不容易腐烂的转基因西红柿，等等。

转基因技术在医学上也派上了大用场。有的小朋友可能听说过，心脏移植是一种治疗疑难心脏病的有效方法。要做这种手术，首先要有心脏，但是目前心脏“供[gōnɡ]不应[yìnɡ]求”，许多病人因此失去了治疗的机会。科学家发现猪的心脏跟人的心脏比较相似，可猪的心脏与人体“不和”。于是，科学家把人的某一种基因导入到猪体内，这样转基因猪的心脏就有了一些人的“脾气”，移植到人体后，可以与人体“和平共处”。目前，这项转基因技术，科学家正在研究中。

【六年级下册《种瓜得豆》教案】

教学目标：

1、朗读课文。了解课文介绍的科学知识。

2、学习课文的表达方法，了解作者是怎样一步一 步地介绍转基因技术及其应用的。并体会课文 语言的特点。

3、学会“泌、玫、瑰”3个会认字和“搬、玫、瑰、 柿、供”5个会写字，掌握“搬家、玫瑰、西红柿、 供不应求”等词语。

教学准备：

1、生字词语卡片。

2、搜集有关基因的资料。

教学过程：

一、谈话激趣，导入新课

1、组织谈话：同学们，你们长得都像谁呢?

2、学生自由发言。(“像爸爸”、“像妈妈”、“像舅舅”、“谁都很像”)

3、教师追问：为什么有的同学与父母那么相似，好像同一个模子倒出来的，有的却找不到与父母相同的特征呢?

4、学生畅所欲言，教师评价。

5、教师描述、揭题：原来在我们的体内有一种叫做基因的东西会遗传，它决定了我们每个人的特点。当妈妈生下我们时，爸爸、妈妈的基因就传到了我们身上，如果这些基因没有发生意外情况时，我们就会长得与爸爸妈妈很像，但如果碰到一些异常的情况，基因就会发生或大或小的变化，这种情况下，我们就长得不怎么像或根本不像爸爸妈妈了。基因啊，是一个很神秘也很神奇的东西，所有生物体内都有基因。今天，我们就来学习一篇与基因有关的文章。

6、教师板书课题：种瓜得豆。

7、学生读题并对课题提出疑问。(种瓜应该得瓜，种豆才会得豆，种瓜怎么会得豆呢?)

8、教师引导读文：从常理来讲，种瓜是不可能收获豆子，但如果你读了课文，认识了基因及其有关技术，你就会豁然开朗了。

二、自学 探究 初读课文，整体感知

1、自由读课文，读准字音，读通句子。

2、自学生字新词，认读识记。

3、理解词语。

发号施令：号，号令;施，发布。发命令，下指示。 前所未有：从来没有过的。 水土不服：水土，泛指自然环境和气候。指不能适应某个地方的自然环境和气候。

乐不可支：形容快乐到了极点。

供不应求：供，供应，供给;求，需要。供应不能满足需要。和平共处：指不同社会制度的国家，用和平的方式解决彼此争端，在平等互利的基础上，发展彼此间经济和文化联系。在本课中指转基因猪的心脏移植到人体后可以在人体中适应并工作。

4、讨论 解疑 默读课文，思考问题。

⑴这篇课文主要介绍了一个什么科学知识?

⑵围绕着这一知识都介绍了哪些内容?

⑶课文是怎样一步一步介绍的，读后，列一个阅读提纲。

5、小组交流后，再全班交流解疑。

全文按总—分结构，每个分述部分都有总述句概括该部分的主要内容。

6、给课文分段，概括段意。

第一部分(第1自然段)：写转基因技术能做到“种瓜得豆”。

第二部分(第2—4自然段)：介绍了什么是转基因技术。

第三部分(第5—10自然段)：介绍了转基因技术的应用。

三、编列提纲，理清层次

指导编写课文第二部分的阅读提纲。

1、认真默读课文第2—4自然段，弄清每个自然段的内容。

2、想想各个自然段间的联系，说说作者是如何向人们说明转基因技术的?

3、指名反馈，全班交流。

4、结合学生的发言，教师示范编写阅读提纲，理清文章层次。

第2自然段以“什么是转基因技术呢?”为过渡段，点明这一部分要写的内容。

第3自然段介绍了基因的作用。

第4自然段介绍了什么是转基因技术。可分两层;

第一层：摸清一些生物体内基因的本领，让一种生物里的“大管家”搬到另一种生物里去发挥它应有的本领。

第二层：转基因技术也因有“水土不服”或不被接受而失败的。

学法小结，独立编写课文第三部分的阅读提纲。

1、指名反馈。

2、集体评议，达成共识。

第5自然段是过渡段，引出科学家研究基因技术的意义。

第6—9自然段写转基因技术在农业生产大有用武之地。

第6段概述;789段举例说明：培育转基因棉花、培育出蓝色玫瑰、培育转基因大豆和西红柿。

第10自然段讲转基因技术在医学上的应用。

四、课堂小结

种瓜得豆看似不可思议，但由于现代转基因技术的应用却完全能够做到。这科学技术的神奇力量真是令人惊叹呀!

作业设计：

1、书写本课生字新词。

2、熟读课文，完整地编写本课的阅读提纲。

种瓜得豆故事

小兔子从小就非常爱学习，平时总是拿着书看啊看啊。从不觉得厌烦。有一次一本书上写着：种瓜得瓜，种豆得豆。这让小兔子想起邻居猪外婆种了一颗土豆，秋天的时候，收获了一蓝子土豆。

知识就是财富，书中说的太有道理了，小兔子灵机一动：种钱，说干就干，他翻遍家中的柜子，找到了一枚钱，种在了地里，天天浇水，常常施肥。

小兔子见到好朋友小麻雀，在他耳边悄悄地说：“秋天时你来帮我点钱啊!”

“好的!”小麻雀欢喜地飞走了。

小兔子见到好朋友小松鼠，在他耳边悄悄地说：“秋天时你来帮我抬钱啊!”

“好的!”小松鼠欢喜地一跳走了。

秋天来了，小麻雀从家拿来一个大箩筐，小松鼠听说钱很重，找来一个松树棒，准备帮着抬。

“起钱了!”此时大家异常兴奋。

可是当小兔子刨开土的时候，只有一玫生了锈的币子，旁边还有一个正在耕耘的蚯蚓。

“怎么会是这样?”失望的小兔子又拿来了书本进行对照：种瓜得瓜，种豆得豆，没错，他就是按书上写的做的。

“一定是蚯蚓拿走了!”小兔子突然抓住蚯蚓，让他交出长的钱来。

“我，根本就没拿什么钱!”蚯蚓很委曲。

“那些钱怎么就没有了呢?只有你在这儿，不是你还有谁?还我钱!”小兔子大喊大叫着。

“我也不知道啊!”

他们的吵声，惊动了正在搞科研的农学专家猴博士，他听完小兔子的话后，笑了，说：“种钱，要到银行种，这个种法是长不出钱的!”

听到猴博士的话后，小兔子把这枚钱拿到银行里，钱串子行长帮他把这枚钱种下了。

不用小兔子施肥，也不用浇水，一年后，果真长出了好多的钱。

小兔子欢喜地拿着这些钱，看到小鸭子在冬天里光着脚很冷，就为他买了一双棉鞋，看到鸡阿婆耳朵冻得通红，就为她买了一条围巾。

兴奋之余，小兔子为自已曾经对蚯蚓的行为感到愧疚，于是他为蚯蚓买了一罐糖水，可是当来到蚯蚓家时，蚯蚓已经冬眠了，小兔子把糖水放到蚯蚓家的屋子里，并在旁边留下一张纸条，上面写着：对不起蚯蚓弟弟，上次是我冤枉你了，请您原谅!春天的时候，欢迎你到我家做客，我教你，咱们一起种钱，一起发财。

种瓜得瓜，种豆得豆的故事点评

这个故事告诉我们，做事情一定要找对方法和平台。瓜和豆都是蔬菜，当然是要在土地里种就会有收成的啊。可是硬币不同哇，还好最后小兔子在猴博士的指导下找对了方法。小兔子找到了“种钱得钱”的正确方法和平台。

调控相关——lncRNA（学习总结）

lncRNA现在这么红并非没有道理，它凭着自身强大而独特的调节功能而撑起了细胞生命领域里的半边天，而近年来与其相关的下游机制研究也是层出不穷。 lncRNA下游调节机制虽说是错综复杂，但通常离不了基因、转录、转录后、翻译、翻译后这五个层次。

1. 就基因水平而言，lncRNA与DNA甲基化间有着千丝万缕的关系。 而这种模型常见于lncRNA和甲基化转移酶（DNMT1、3等）结合，并将该酶定位至基因的启动子（CpG岛）以及甲基化，进而抑制基因转录。

（ps.这一部分跟我之前看的m6A的书可以联系上）

此外，位于核内的lncRNA还可直接结合DNA序列，抑制转录过程；又或者结合转录因子、RNA聚合酶复合物以及通过组蛋白修饰来影响转录过程。 （组蛋白修饰可以作为单独一门学科来研究）

而且lncRNA不仅能在核内大展拳脚，因着自由穿梭核内外的这份特性，它在胞浆内也是锋芒毕露。且不说大家耳熟能详的ceRNA，lncRNA还可通过mRNA的可变剪切、定位以及稳定性，来影响细胞内生理功能的行使。

2.另外， lncRNA也会促进pri-miRNA剪切 ，甚至有时其自身就亲自客串为miRNA的前体 ，在被剪切为miRNA后，来抑制靶基因mRNA的表达水平。常言道，技多不压身，一路开挂的lncRNA也顺道插手了蛋白翻译过程，要么结合mRNA 5’UTR,促进翻译；要么结合特定蛋白，靶向mRNA,抑制翻译；要么仰仗着sORF翻译多肽来自产自销。

lncRNA如此全能，也让蛋白质心痒不已。两者一拍即合，蛋白质的磷酸化修饰、定位等都在lncRNA的影响下有条不紊的进行着。

尽管以上种种就是lncRNA发挥功能的十八般武艺，但仍要谨记贪多嚼不烂，小伙伴们只需依据lncRNA的亚细胞定位（与调节功能有关）择其一认真练之，就必然会有所收获。

1.定位核内，先考虑附近100万bp内的基因表达是否有影响，有则为cis-顺式作用;反之，为trans-反式调控基因，就可依据RNA pulldown筛选与lncRNA结合的蛋白；

2.定位胞浆内，若结合RNA，首选ceRNA；若结合蛋白，则可考虑mRNA可变剪切、稳定性，调节基因翻译以及蛋白修饰等机制。

3.而就lncRNA分子机制研究的总体而言，始终是有两个主要策略贯彻其中。

1.  以非编码RNA为对象入手，这是非编码RNA研究的常规套路。 从不同刺激或处理的转录组或表达组入手，先通过差异倍数和显著性，及非编码RNA的基因组定位信息等筛选功能性候选RNA分子；再通过正反功能以及细胞-动物实验进行二次验证。

该策略稳定可靠，风险性较小，而难点在于后期分子机制的研究上，若只涉及明星通路及相关蛋白，则是探讨了lncRNA的间接分子机制；但要想将文章拔高档次，还需以RNA-pulldown，RIP，ChIRP等实验技术确定lncRNA相互作用分子以及作用结合位点，来挖掘lncRNA的直接分子机制。

2.  从某一个分子作用模式入手，恰恰反其道而行之。 先靶向一个重要的蛋白分子，比如信号转导分子、酶类或者转录因子等；或者一个细胞亚结构，如线粒体、外泌体等，通过RIP-seq或者RNA-seq检测其结合的或者包含的RNA，按照富集的倍数和显著性筛选候选RNA分子，后面通过siRNA或者高表达的方法筛选功能RNA。

该策略从课题设计开始就有着明确指向的功能分子机制，在后续的分子机制研究中比较方便展开；但难点是前期如何做好RIP-seq和细胞亚结构的有效分离，这是后续实验可靠性和可行性的重要保障。

两种策略在实验技术上有部分重叠，但也有各自独特的实验技术需求或数据分析策略。 不同策略适应于不同的课题和实验室背景，在选择的时候可以根据课题特点和实验室技术体系进行取舍。当然，两种策略也可以同时应用，相得益彰，相互作证，起到更好验证效果。

插入我十分珍藏的一张RNA之间的互作关系来收尾

再附赠多组学RNA研究的文章一篇：

这篇帖子以解螺旋一篇文章作为框架，为表尊重，附上链接   

蛋白的表达与纯化

pET，原核表达金标准（转）

pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点

· 是原核蛋白表达引用最多的系统

· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低

· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制

· 提供各种不同融合标签和表达系统配置

· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌

· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物

· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化

阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET 系统概述

pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平

pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 λ DE3 溶原菌。

有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。虽然不如用 IPTG 诱导 λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性 T7 lac 启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。

控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。

选择 pET 载体

所有的 pET 载体均来自 pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。

选择要点

选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

· 所表达蛋白的用途

· 所表达蛋白的已知信息

· 克隆策略

pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。 LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭 ( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b （ + ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。

使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的 FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。

各种融合标签和相应 pET 载体见列表。一些 pET 载体带有数个***的融合标签，作为 5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC 载体 Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。

pET NusA 融合系统 43.1

在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白

新推出的 pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与 495aa NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中 4000 个以上蛋白进行可溶性建模， NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同 NusA 融合蛋白进行的试验中，大于 85% 的表达蛋白都是可溶的。 pET-43.1 载体含有 Nus.Tag 融合伴侣并与 trx/gor 突变体 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用 pET-43.1 载体和这些 trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。

优点

· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侣

· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可选择的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合标签

· 凝血酶和肠激酶切割位点

· 多克隆位点位于所有读码框中

· 与 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭

pET 宿主菌株感受态细胞

所有 pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

（ DE3 ）指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。

HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。

NovaBlue 适合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。

Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。

Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。

重组蛋白的纯化

为什么说细胞间也有用来传递免疫信号的快递？

随着快递的推广应用，我们日常生活中的货物递送变得异常方便。有趣的是，科学家们发现，在细胞的世界里也有属于他们的“快递”，叫细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）。

EVs是一种脂质双分子膜包裹的小囊泡，就好像是细胞间进行远程通讯的一种快车 (Express Vehicle)。1983年科学家首次在绵羊网织红细胞中发现EVs，当时多数人认为它是细胞排出废物的一种方式。然而，2007年，瑞典哥德堡大学的Lötvall实验室的研究则颠覆了以往的认知。研究者在小鼠和人肥大细胞系，以及原代小鼠肥大细胞产生的外泌体中发现mRNA和microRNA，并且携带的RNA可以被递送至新细胞中发挥功能，实现细胞间的遗传信息交换，这一里程碑式的发现使EVs领域变得活跃起来。

Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）是天然免疫中一类非常重要的模式识别受体，负责识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）以及损伤相关分子模式（danger-associated molecular patterns, DAMPs），从而激活下游的免疫反应。TLRs通路的紊乱或失调会引起机体产生各类炎症反应或自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。

这项细胞外囊泡领域创新研究工作，为细胞间天然免疫信号转导机制的阐释指明了新方向，并且为进一步开发针对免疫疾病诊疗新方案提供了思路。” 国际外泌体协会学术部主任、美国约翰霍普金斯大学医学院Kenneth W. Witwer教授评价该工作时称：“来自清华大学尹航教授课题组的张莹及同事在发表在Science Advances杂志上的最新研究中，报道了关于早期预警系统如何感知到感染信号这一重要现象。这项工作今后可能对机体感染相关的疾病治疗研究有重要启示，并为细胞外囊泡通讯的特定分子机制研究奠定了基础。”