不同肿瘤微环境免疫细胞检测（细胞微环境对肿瘤细胞的影响）

本文目录一览：

• 1、盘点季 | 空间转录组分析工具合辑（上）：去卷积
• 2、空间转录组技术的应用
• 3、科普讲堂|什么是单细胞测序？
• 4、10X单细胞空间联合分析之十一（CellTrek）
• 5、国卫院首度发现：琥珀酸在肿瘤微环境扮演关键角色

盘点季 | 空间转录组分析工具合辑（上）：去卷积

之前我已经分享过很多空间转录组的分析工具（👉 都可以在 空间组专辑 里找到哟）。为了方便大家查找，我将空间转录组常用的 去卷积工具 和 聚类工具 做了汇总！

# 去卷积工具合辑 #

空间分辨转录组学实验分析的关键步骤之一是确定细胞类型。细胞类型去卷积，是用于估计混合物（数据点）中每种细胞类型的比例以及每个细胞的基因表达水平（在同一数据点内）的算法。

SPOTlight能够将空间转录组与scRNA-seq数据集成，从而推断复杂组织中细胞类型和状态的位置。 其基于一个种子的非负矩阵因子分解回归（Seeded NMF regression ），使用细胞类型标记基因和非负最小二乘(NNLS)初始化，随后去卷积空间转录组数据捕获位置(spot)。

性能评估： 通过模拟不同的参考数量和质量数据证实SPOTlight在低深度测序或小规模的scRNA-seq参考数据集中也具有较高的预测精度；小鼠大脑的SPOTlight去卷积正确地映射了皮质层的细微神经元细胞状态和海马的特定结构；作为概念验证，开发团队将SPOTlight应用于胰腺癌（PDAC）数据，并确定了肿瘤微环境中临床相关的免疫细胞状态的空间组织。

工具获取：

SpatialDWLS可以概括为两个步骤，第一个步骤使用细胞类型富集分析方法来确定哪些类型的细胞在每个位置具有较高的概率，第二个步骤使用阻尼加权最小二乘法（DWLS）的扩展来确定指定位置的细胞类型的精确组成。 与现有的去卷积方法相比，关键区别在于SpatialDWLS包含额外的过滤步骤，以去除不相关的细胞类型，从而增强特异性。

性能评估： 对一个模拟的空间转录组学数据集进行评估时，SpatialDWLS在具有较低的均方根误差（RMSE）和计算时间方面优于RCTD和stereoscope；开发团队应用SpatialDWLS分析了10X Genomics Visium数据集，该数据集映射了小鼠大脑中的空间转录组谱；此外，SpatialDWLS还被应用于确定在整个胚胎心脏发育过程中细胞类型组织在空间和时间上的变化。

工具获取： 在Giotto中可以轻松访问SpatialDWLS方法，这是一个用户友好的软件包，包含大量用于空间转录组数据分析和可视化的计算工具。

RCTD利用注释的scRNA-Seq数据创建数据中预期细胞群的细胞类型概况，然后使用监督学习方法用细胞类型标记空间转录组pixels。由于这一分析的主要障碍之一是目前的空间转录组学数据集可能在一个pixel内包含多种细胞类型，RCTD还可以拟合一个统计模型，以确定一个pixel内存在的多种细胞类型，并将scRNA-Seq和SRT数据集之间的平台效应归一化。使用这种方法， RCTD能够跨平台对细胞进行分类，准确率接近90%。与其他监督学习方法一样，使用该工具可以检测的细胞类型受限于参考数据集的准确和完整注释。

性能评估： RCTD可以准确地发现模拟和真实空间转录组数据中细胞类型的定位。此外，RCTD还可以检测细微的转录组差异，从而在空间上映射细胞亚型。最后，开发团队使用RCTD计算预期的细胞类型特异性基因表达，从而能够根据细胞的空间环境检测基因表达的变化。

工具获取：

DSTG是一种新的基于图形的人工智能方法，其通过基于图形的卷积网络对空间转录组数据（ST）进行去卷积，可利用scRNA-seq数据揭示ST数据中的细胞混合物。 首先，DSTG从scRNA-seq数据构建合成pseudo-ST数据。DSTG使用共享邻近算法学习pseudo-ST数据和real-ST数据的spot映射链接图，链接图捕获spot之间的内在拓扑相似性，并将pseudo-ST和real-ST数据合并到同一个图中进行学习。然后，基于链接图，使用半监督图卷积网络（GCN）学习局部图结构和基因表达模式的潜在表示，以解释spot的各种细胞组成。

性能评估： DSTG不仅在不同技术生成的合成空间数据上表现出优异的性能，而且还有效地识别了小鼠皮层、海马切片和胰腺肿瘤组织中细胞的空间组成：通过对从外周血单核细胞（PBMC）和其他组织生成的合成数据进行基准评估，DSTG在预测的细胞混合和实际的细胞组成之间显示了良好的准确性；同时，DSTG在复杂组织(包括小鼠皮层、海马和人胰腺肿瘤切片)的ST数据上也显示出与HE染色观察高度一致的结果。

工具获取：

stereoscope首先使用单细胞数据来描述每个细胞类型的表达谱，然后在每个捕获位置内找到这些类型的组合，以最好地解释空间数据。 该模型框架利用单细胞数据推断空间数据中每个捕获位置的每个细胞类型的比例估计，从而消除了对空间数据分析时对要素或簇等抽象实体的任何解释或注释的必要性。

性能评估： 为了证明stereoscope的实用性，研究团队使用来自不同实验平台的数据，并对来自小鼠大脑和发育期心脏的细胞类型进行了空间映射，其排列方式与预期一致；为了说明stereoscope如何与其他空间技术结合使用，研究团队分析了海马和小脑的Slide-seq数据，这些数据成功地再现了该技术最初发表的结果；此外，研究团队设计了一个程序从真实的单细胞数据中收集类似于从空间技术获得的合成数据， 将stereoscope与两种最近发表的方法（DWLS和deconvSeq）进行比较，结果证实stereoscope的实现优于其他两种方法。

工具获取：

此外，还有预印发表的工具： Cell2location ，一个原则性和通用的贝叶斯模型，其集成了单细胞和空间转录组学，以全面的方式在原位绘制细胞类型； SpatialDecon ，一种在空间分辨率的基因表达研究区域内，通过scRNA-seq定义的细胞群的量化算法。其获得的细胞丰度估计值是空间分辨的、颗粒状的，并与高度复用的基因表达数据相匹配...

首发公号：国家基因库大数据平台

参考文献

[1] Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, et al. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes[J]. Nucleic acids research, 2021, 49(9): e50-e50.

[2] Dong R, Yuan G C. SpatialDWLS: accurate deconvolution of spatial transcriptomic data[J]. Genome biology, 2021, 22(1): 1-10.

[3] Cable D M, Murray E, Zou L S, et al. Robust decomposition of cell type mixtures in spatial transcriptomics[J]. Nature Biotechnology, 2021: 1-10.

[4] Song Q, Su J. DSTG: deconvoluting spatial transcriptomics data through graph-based artificial intelligence[J]. Briefings in Bioinformatics, 2021.

[5] Andersson A, Bergenstråhle J, Asp M, et al. Single-cell and spatial transcriptomics enables probabilistic inference of cell type topography[J]. Communications biology, 2020, 3(1): 1-8.

[6] Kleshchevnikov V, Shmatko A, Dann E, et al. Comprehensive mapping of tissue cell architecture via integrated single cell and spatial transcriptomics[J]. bioRxiv, 2020.

[7] Danaher P, Kim Y, Nelson B, et al. Advances in mixed cell deconvolution enable quantification of cell types in spatially-resolved gene expression data[J]. bioRxiv, 2020.

空间转录组技术的应用

在生物学中，“空间”这个概念具有非常重要的意义，因为它可以让我们用来描述生物网络的相互作用，生物网络中每个细胞都受到其周围环境的影响，例如：

• 想了解多细胞生物中单个细胞的分子特性，只有知道它们的物理位置，才能完全了解。原因是组织中不同微环境中的细胞表达着特定的基因，他们受到周围细胞的影响。

• 在胚胎发育的不同阶段，这种现象指导着沿主胚轴基因表达的逐渐形成。随后指挥并激活相应基因的发育过程，从而形成特定的器官。

• 肿瘤微环境，构成肿瘤的几个癌细胞亚群在结构特征和基因表达方面可能完全不同。如果我们进一步放大单个细胞的的微环境，空间的概念就很重要，因为细胞内的功能和信号传递需要细胞内精确的位置参数。沿着这条线，RNA 分子的亚细胞位置可以推断出有关 transcriptional snapshot 及其实际生物学意义的重要信息。

由于研究者们认识到空间位置信息的重要性，所以这样的需求也就促进了空间转录组测序技术的发展。

接下来，我将根据空间测序技术所应用到的三个领域：肿瘤、发育、疾病分别列举一篇文献的简要介绍，供您参考。

【发表期刊】Nature Biotechnology

【影响因子】45.117

【发表时间】2020.1

【研究方向】肿瘤

【文章摘要】虽然应用单细胞转录组在治疗患者肿瘤过程中已经发现了多种细胞亚群，并突出了肿瘤微环境中细胞间的相互作用，但在测序前制备单细胞悬液的组织解离导致了组织中细胞空间信息的丢失，从而限制了我们对肿瘤微环境中细胞的相互作用和组织的理解。为了解决组织中细胞类型的空间组成，我们利用空间转录组测序技术去计算映射到该区域的特异性基因与由单细胞转录组数据计算的细胞类型特异性基因之间的重叠程度，推断出特定细胞类型在给定组织区域的富集。通过对不同患者的原发性 PDAC 肿瘤的研究，我们确定了特定细胞类型和亚群在组织的空间受限区域的情况。应用这两种技术的结合可以去分析任何结构复杂的组织，并有潜力在生物领域提供有意义的新发现。

【方案设计】作者分别取两名 PDAC 患者的2例新鲜 PDAC-A 和 B 肿瘤组织进行研究，同时进行 scRNA-seq 和空间转录组建库测序分析。最后运用多模式相交分析（Multimodal intersection analysis，MIA），将单细胞转录组数据和空间转录组数据整合，进行 PDAC 组织的细胞类型分析，以及组织对应不同空间区域相关的细胞分布情况。

【思路总结】

• 通过单细胞转录组测序分析（scRNA-seq）结合 CNV 及荧光标记实验验证了 PDAC-A 包含两种癌症细胞群 cluster1 (TM4SF1)和 cluster2 (S100A4)，PDAC-B 包含一种癌症细胞群 cluster1（TM4SF1）

• 通过病理医生的形态学鉴定结果进行肿瘤组织的不同区域定义，将形态学鉴定的结果与空间转录组测序的降维聚类结果相比对，发现两个不同方法对组织区域的鉴定结果是一致的。

• 运用 MIA 算法整合分析发现在组织空间受限区域中含有特定的细胞类型和特定细胞亚群的富集。例如 PDAC-A 的成纤维细胞特异性基因与 ST 分析结果中的特定区域的一组基因具有很强的一致性；除此之外，还发现了导管上皮区域富含导管细胞，胰腺组织区域富含腺泡细胞和分泌细胞。依据 MIA 结果绘制了不同肿瘤样本微环境的特点、免疫环境状态、应激水平以及细胞之间相互作用的模式，有助于对患者预后进行预判。

• 应用 IF 荧光实验实验进行相应的结果验证。

【发表期刊】Cell

【影响因子】36.430

【发表时间】2019.12

【研究方向】发育

【文章摘要】人类心脏形态的形成过程尚不完全清楚。它的所有特征需要一个深入探索组织范围内的基因表达的技术并具有单细胞空间分辨率。本文，我们提出了一种方法，可以全面的揭示胚胎心脏在三个不同发育阶段的细胞类型，并将细胞类型特定的基因表达映射到特定的解剖结构区域。空间转录组学鉴定了在每个发育阶段对应不同解剖区域的独特基因图谱。再结合单细胞转录组测序鉴定的人胚胎心脏细胞类型，证实并丰富了胚胎心脏基因表达的空间注释情况。然后使用原位测序来细化这些结果，并创建三个发育阶段的空间亚细胞图谱。最后，我们制作了一个人类心脏发育的公用网络资源，以利于后期对人类心脏发育的研究。

【方案设计】共取了3个人的样本，分别是：孕4.5-5周（4个 sections）、6.5周（9个 secitons）和9周（6个 sections）的心脏组织，采用空间转录组技术、原位测序技术、单细胞转录组技术三种技术手段，从时间和空间两个维度展示了人类心脏发育表达的模式。最后，结合三种技术进行人类胚胎心脏 3D 建模，构建了全方位组织基因表达图谱。

【思路总结】

• 通过空间转录组测序技术对不同孕期的胚胎心脏切片进行空间转录组技术分析，经过降维聚类，差异表达等分析，最终获得了10个 cluster 细胞类型，并标注了10个 cluster 特异性表达的基因。

• 运用单细胞转录组测序对孕6.5周胚胎心脏分割两部分进行 scRNA 建库测序分析，经过降维聚类，获得15个 cluster 细胞类型，鉴定到的细胞类型与先前报道一致。

• 利用原位测序（in situ sequencing，ISS）的亚细胞空间分辨率特性，运用 pciSeq 方法创建了一个综合概率，确定 scRNA 定义的细胞类型的空间细胞图谱，从而实现单细胞分辨率的基因表达时空分析。

【发表期刊】Scientific Reports

【影响因子】4.011

【发表时间】2019.12

【研究方向】疾病

【文章摘要】我们的目的是探索类风湿关节炎(RA)和脊椎关节炎(SpA)患者的滑膜活检，使用空间转录组测序作为在这些慢性炎症疾病炎症部位进行无偏向 mRNA 研究的原则方法。对感染关节的滑膜组织切片进行 st 分析。转录组数据进行差异基因表达分析(DEA)、通路分析、Xcell 分析免疫细胞类型鉴定和免疫组织化学(IHC)验证。ST 技术允许对区域进行选择性分析。

有趣的是，因此我们分析了形态上不同的单核细胞浸润区域。在 RA 中，顶部差异表达基因显示了适应性免疫反应和 T-B 细胞相互作用，而在 SpA 中，这些差异表达基因暗示了与组织修复相关的功能。利用空间解析的基因表达数据，覆盖在高分辨率的组织图像上，我们在硅上数字描绘预先选择的细胞类型。RA 表现出中央记忆 T 细胞过多，而 SpA 效应记忆T细胞最突出。因此，ST 允许更深入地了解细胞机制和组织的多样性，从慢性炎症疾病。

【方案设计】分别取 RA 和 SpA 各3名患者，取其髋部或者膝盖处的滑膜组织进行空间转录组建库测序分析，揭示了慢性炎症性疾病的细胞机制和在组织中的功能的多样性。例如在 RA 中，适应性免疫反应与T-B细胞相互作用，而在 SpA 中，适应性免疫反应与组织修复功能相关。

【思路总结】

• 取每个患者病患处3个部位滑膜组织，以患者为单位分别将其数据合并在一起作为一个 bulk 对单个组织切片进行纠正比对。由 bulk 和单个组织差异表达分析来看，RA与T细胞、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）关联更强，而SpA组织的特征更多在于软骨损伤和修复系统的过程。

• 通过 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) and Metascape ()对差异表达基因进行功能和分子网络通路分析，发现 RA 与适应性免疫应答相关，SpA 与细胞外基质相关、与软骨损伤修复过程相关。

• 运用 Xcell 软件进行细胞类型的鉴定，展现了空间组织区域细胞的类型。

10x Genomics Visium Spatial 空间转录组测序技术弥补了原空间转录组分辨率较低、单细胞转录组缺乏空间信息等缺点，实现了组织内细胞在空间上全面无偏的检测分析。

目前10x Genomics Visium Spatial 空间转录组测序技术已经测试过人和小鼠的多种组织类型，如：肿瘤、淋巴、大脑、心脏、肝脏、肾脏、胃等。并且，该技术也适用于所有常见的哺乳动物中。

科普讲堂|什么是单细胞测序？

简介

单细胞测序技术，简单来说，就是在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术。传统的测序，是在多细胞基础上进行的，实际上得到的是一堆细胞中信号的均值，丢失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。而单细胞测序技术能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息，从而很好的解决了这一问题。

单细胞测序技术自从2009年首次问世，在这十几年以来持续不断地发展。尤其是近几年，单细胞测序出现了爆发式的发展和普及。2011年，《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。2013年，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，《Nature Methods》杂志将单细胞测序的应用列为2013年年度最重要的方法学进展。2017年10月16日，与 “人类基因组计划” 相媲美的 “人类细胞图谱计划” 首批拟资助的38个项目正式公布，引爆单细胞测序新时代。

单细胞表达谱测序与 bulk RNA测序对比

传统的二代测序中，最为人熟知的就要数RNA-seq了（图2）。RNA-seq是提取组织、器官或一群细胞的混合RNA(bulk RNA)进行测序，能够得到的是一群细胞的转录组的平均数据，细胞群体中单个细胞的特异性信息往往被掩盖（比如特异表达的基因或RNA不同的剪接体）。而随着对生物结构功能的深入研究，人们越来越清楚地认识到，哪怕看似相同的细胞群，细胞之间的转录组表达水平也是存在差异的。以肿瘤为例，肿瘤中心的细胞，肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞，乃至远端转移的细胞，其转录组等遗传信息一定是存在差异的，而传统的研究手段通常将整个肿块整体进行研究，或者将肿块简单分区分割，得到每一部分细胞基因表达的平均值，丢失了每个细胞的异质性信息，使科研人员对肿瘤微环境中各种细胞转录组表达及免疫功能的理解和认识始终无法深入。

由此可见，为了得到原始和真实的细胞遗传信息，对转录组的分析须在单细胞水平上展开。单细胞表达谱测序技术可以从混杂组织中捕获单个细胞，并能从中够获取单个细胞的表达信息，检测出混杂样品中细胞的异质性数据。目前单细胞的捕获策略大体分两种：

· 早期的单细胞捕获方式

早期的单细胞获取方式，是通过一定的技术手段，将单个细胞分离出来，并利用SMART-Seq2或商业化的SMART-Seq4试剂独立构建测序文库，最终进行测序。捕获方式包括：有限稀释法，流式分选法，激光切割法，显微操作法（图3前四种）。这些方法虽然各有各的优点，但各自的缺点也十分明显，比如流式分选法对于难度的计算易存在误差；流式分选法不适用于微量样本；激光切割法操作复杂；显微切割法的细胞通量低等。而它们的共同缺点，就是捕获成本高。

· 使用微流控技术获取单细胞

通过微流控芯片将单个细胞捕获至油滴（图3最后一种），就是微流控技术。这种方式的优点是细胞通量高，周期快速，成本低，细胞捕获效率高，并且商业化仪器操作简便。其核心思想是将不同的细胞赋予一段不同的barcode序列，建库时，携带相同barcode序列的核酸分子被认为来自同一个细胞，人们就可以一次性为成百上千的细胞建库并顺利区分它们。

以目前占全球95%市场份额的10X Genomics Chromium转录组测序为例，细胞与逆转录试剂预混在一起，通过微流控芯片的一条通道，与另一通道中的携带百万个不同标签（barcode）的凝胶珠（gel beads）相遇，穿过油幕的同时被包裹在一个油滴中，便可以轻松得到一个细胞和一个凝胶珠包在一起的油包水滴GEMs（图4）。

对于3’单细胞转录组来说，每一个凝胶珠携带足量条的核酸链，而每条核酸链由read1 primer，细胞标签（barcode），分子标记（UMI），poly(dT)组成。一个凝胶珠上所有的核酸链的细胞标签（barcode）是相同的序列，而不同于其他凝胶珠上的细胞标签（barcode），用于标记细胞。一个凝胶珠上所有的核酸链的分子标记（UMI）是不同的，用于标记不同的RNA序列（图5）。

逆转录在油包水隔离的小室中进行，细胞破裂释放出mRNA，其3’端poly(A)序列被凝胶珠上的poly(dT)捕获。这样，同一个细胞的mRNA带有同一个细胞标签（barcode），可以与别的细胞的mRNA区分开；每条mRNA带有不同的分子标记（UMI），可以用来计算不同基因转录本的拷贝数，避免PCR扩增偏差（图6）。之后，对单个样本进行cDNA回收、建库和测序，分析测序下机数据识别barcode，得到单个细胞的表达矩阵、分群等信息。

由于这种单细胞检测平台的出现和商业化，使得单细胞测序技术的使用门槛大大降低，不仅实现了细胞通量（实际测到的细胞数量）的飞跃，而且大幅降低了单个细胞的检测成本。

单细胞测序的应用

单细胞测序技术，是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点。

随着精准治疗时代的到来，未来单细胞技术，将会有助于人类的科学研究以及临床应用，尤其是在肿瘤、微生物、神经科学、免疫学等领域，应用会越来越广泛。

· 肿瘤研究上的应用

2021年6月15日，Cell杂志发表了一篇通过单细胞分析探测肿瘤的血管选定研究的文章。该研究采用了单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)，对31964个具有AAT（抗血管生成）抗性小鼠的肺肿瘤血管内皮细胞（TECs）和周细胞进行了检测。结果显示实验组与健康对照组的TECs和周细胞的表达谱都非常相似。同时还发现基质重塑巨噬细胞有助于浸润性癌细胞的血管选定；M1样巨噬细胞亚型可使血管细胞保持静止。

该研究重在体现对抗VEGF（血管内皮生长因子） 阻断 AAT时，肿瘤血管选定的临床重要性，而且有助于确定肿瘤血管的细胞表型，从而在研究抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤细胞的生长和转移的道路上向前迈进了一大步。

· 新冠治疗研究中的应用

2020年7月，北京大学谢晓亮团队在Cell上发表了一篇关于新冠病毒特效药的文章。此项目首先从60名新冠康复病人的血液中分离出B细胞，利用单细胞转录组+单细胞BCR测序技术对这些B细胞进行检测，筛选出8558种病毒蛋白结合抗体序列，并找出14株高活性的中和抗体。之后进行小鼠实验，最终成功筛选出一种非常有效的中和抗体BD-368-2。经实验证实，此中和抗体可以大幅度提升新冠治愈率，缩短治愈时间，甚至可以提供短期的病毒免疫，在治疗和预防方面都发挥重要作用。

· 阿尔兹海默症研究中的应用

2019年5月,Nature报道，通过对24名阿尔茨海默病人和24名正常人尸检大脑样本的8万个细胞进行单细胞转录组测序。研究不仅分析出兴奋性和抑制性神经元，还分析稀有的非神经元脑细胞，如少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。这些细胞类型中的每一种在阿尔茨海默病患者中都表现出明显的基因表达差异。其中，轴突再生和髓鞘形成相关的基因在阿尔茨海默症中表现出明显差异。

单细胞测序的未来

目前，全球潜在科研市场体量已经达到130亿美元以上，单细胞测序技术的市场更以年均20%以上的速度逐年增长。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔。随着测序技术的发展和测序水平的提高，单细胞测序技术能够解析细胞间更加细微的差异，正在推动癌症及肿瘤研究、发育生物学、微生物学研究、免疫、以及神经科学领域向前发展，并逐渐成为生命科学研究的焦点。

如今，单细胞测序正如火如荼，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解转录组、免疫组和表观组的多样性。我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进！

10X单细胞空间联合分析之十一（CellTrek）

单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 方法可以分析单细胞的转录组，但不能保留空间信息。 相反，空间转录组学 (ST) 分析可以描绘组织切片中的空间区域，但没有单细胞基因组分辨率。 在这里，作者开发了一种称为 CellTrek 的计算方法，它结合了这两个数据集来实现单细胞空间映射。 测试使用模拟研究和两个原位数据集对 CellTrek 进行了基准测试。 然后，应用 CellTrek 从正常小鼠大脑和肾脏组织的现有数据集中重建细胞空间结构。 分析还对两个导管原位癌 (DCIS) 组织进行了 scRNA-seq 和 ST 实验，并应用 CellTrek 来识别仅限于不同导管的肿瘤亚克隆，以及与肿瘤区域相邻的特定 T 细胞状态。 数据表明，CellTrek 可以准确地绘制不同组织类型中的单个细胞，以解析它们的空间组织。

单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 方法极大地扩展了我们对不同细胞类型的基因表达程序及其在发育和疾病中的作用的理解。然而，scRNA-seq 在组织解离步骤中固有地丢失了细胞空间信息， 这对于理解细胞微环境和细胞间相互作用至关重要 。虽然空间测序方法，包括空间转录组学 (ST) 和 Slide-seq，可以在空间上描绘跨组织切片的基因表达，但它们仅限于测量具有细胞混合物的小区域，并且不能轻易提供单细胞信息。为了解决这个问题，已经设计了计算方法（例如， cell2location 、 RCTD ）来将 ST spot解卷积为不同细胞类型的比例。然而，空间去卷积方法仅限于推断每个spot的细胞类型比例，无法实现单细胞分辨率。此外，去卷积方法将细胞类型进一步解析为反映不同生物学功能的更细粒度的“细胞状态”（表达程序）的能力有限。 最后，大多数反卷积方法只能预测分类标签，而不能以空间分辨率推断连续的细胞信息（例如，谱系轨迹、基因特征、连续表型） 。

在这里，作者开发了 CellTrek，这是一种计算工具包，可以根据 scRNA-seq 和 ST 数据将单个细胞直接映射回组织切片中的空间坐标。 这种方法提供了一种不同于 ST 反卷积的新模式，能够更灵活、更直接地研究具有空间地形的单细胞数据。 CellTrek 工具包还提供了两个下游分析模块，包括用于 空间共定位分析 的 SColoc 和用于空间 共表达分析 的 SCoexp。 使用模拟和原位数据集对 CellTrek 进行了基准测试。 然后，将 CellTrek 应用于来自正常小鼠大脑和肾脏组织的现有数据集以及从两个人类导管原位癌 (DCIS) 样本生成的数据，以研究单细胞空间分辨率下细胞类型/状态的组织。

CellTrek 首先将 ST 和 scRNA-seq 数据集成并共嵌入到共享特征空间中

CellTrek 使用 ST 数据训练multivariate random forests (RF) model，以使用共享降维特征预测空间坐标。 引入了对 ST 数据的空间非线性插值以增加空间分辨率。 然后将训练后的模型应用于共嵌入数据以导出 RF 距离矩阵，该矩阵测量 ST spot和由空间坐标监督的单个细胞之间的表达相似性。 基于 RF 距离矩阵，CellTrek 在阈值化后使用相互最近邻 (MNN) 生成稀疏spot细胞图。 最后，CellTrek 从相邻spot传输细胞的空间坐标。 为了提高兼容性，CellTrek 可以接受从其他方法（例如 novoSpaRc）计算的任何细胞位置概率/距离矩阵作为细胞空间图表的输入。 此外，提供了一个图形用户界面 (GUI)，用于对结果 CellTrek map进行交互式可视化。

为了概括不同细胞类型之间的空间关系，开发了一个下游计算模块 SColoc，它将 CellTrek 结果汇总为图形抽象

提供了三种方法，即 Kullback-Leibler 散度 (KL)、Delaunay 三角测量 (DT) 和 K-最近邻距离 (KD)，用于计算细胞类型之间的空间差异。 基于相异度矩阵，SColoc 可以构造一个最小生成树 (MST)，表示简化的空间细胞邻近度。 上述步骤将在引导样本上迭代执行以生成共识矩阵（在差异或 MST 上）。 此后，图形将通过具有可调边缘阈值和颜色映射功能的 GUI 呈现。 此外，SColoc 提供了一个 Kdistance 度量，用于测量细胞到选定参考组的空间距离。

为了研究不同的表达程序是否分布在不同的地形区域，作者开发了 SCoexp，它利用 CellTrek 坐标来检测目标细胞内的共表达基因模块。

首先，SCoexp 根据它们的空间距离计算空间核权重矩阵。 使用这个权重矩阵，SCoexp 计算空间加权基因共表达矩阵。 此后，SCoexp 利用共识聚类 (CC) 或加权相关网络分析 (WGCNA) 来识别基因模块。 对于识别的模块，我们可以计算模块分数并investigate它们的空间组织。

为了对 CellTrek 的性能进行基准测试，利用了三个空间数据集，1) 具有自定义空间模式的模拟 scRNA-seq 数据集

生成了三个相应的 ST 数据集，每个spot聚合了五个空间最近的细胞

将 CellTrek 应用于 scRNA-seq 和 ST 数据以重建它们的空间细胞图。 然后，将CellTrek 与另外两种细胞制图方法进行了比较：1) NVSP-CellTrek，它使用基于参考的 novoSpaRc（一种空间重建方法）来计算细胞空间概率矩阵，然后利用 CellTrek 生成空间图，以及 2) Seurat coordinate transfer (SrtCT) which uses the data transfer approach to transfer ST coordinates to single cells。 CellTrek 和 NVSP-CellTrek 都重建了模拟数据的原始空间格局，而 SrtCT 只重建了细胞之间的粗略空间关系，不能准确地映射细胞

与 NVSP-CellTrek 相比，CellTrek 以更高的空间密度绘制了更多的细胞。 为了定量评估这些方法，我们使用 KL 散度将细胞绘图结果的空间密度与不同细胞类型的原始空间分布进行了比较。 CellTrek 和 NVSPCellTrek 均以低 KL 散度实现了良好的性能，而 SrtCT 与参考分布的差异要大得多

在果蝇胚胎数据中，CellTrek 准确重建了原始空间布局，三种方法中 KLdivergences 最低

在 CellTrek 结果中进一步研究了几种已知的果蝇胚胎发生基因，并发现了与先前研究一致的空间模式

在小鼠胚胎数据中，我们发现 CellTrek 和 NVSP-CellTrek 准确地重建了原始空间结构，而 CellTrek 在第 5、9 和 17 组中显示出略高的 KL-divergences

为了研究 CellTrek 是否可以揭示小鼠胚胎发育的空间模式，我们选择了一组肠管细胞，发现一些标记基因与之前的研究存在空间一致性

接下来评估了 CellTrek 在三种不同模拟设置下对模拟数据的性能：1)read counts，2) 空间随机性，以及 3) 组织密度。 我们使用 KL 散度和 Pearson 相关性在 CellTrek 地图和参考之间的细胞空间坐标上评估 CellTrek 性能。 在三个模拟中（每个模拟有八个条件），与置换测试相比，CellTrek 实现了良好的空间重建性能，并显示出更低的 KL 散度和更高的相关性。 然而，增加空间随机性会影响 CellTrek 的性能并降低统计显著性，同时减少read counts或spot/cell密度将导致稀疏的细胞图。 总体而言，该数据表明 CellTrek 是一种在不同实验条件下进行单细胞空间映射的稳健方法。

将 CellTrek 应用于公共小鼠大脑 scRNA-seq (Smart-seq2)和 ST 数据集（Visium，10X Genomics）。 我们将 CellTrek 与 NVSP-CellTrek 和 SrtCT 方法进行了比较。 CellTrek 按照 L2/3 端脑内 (IT)、L4、L5 IT、L6 IT、L6 皮质丘脑 (CT) 和 L6b 的顺序重建了层流兴奋性神经元亚型的清晰层结构，与大脑皮层结构相匹配。 NVSP-CellTrek 显示出类似的空间层趋势，从而证明了 CellTrek 方法的灵活性和一致性。 然而，NVSP-CellTrek 在某些区域导致了稀疏的细胞映射。 SrtCT 未能准确地将细胞位置投影到组织学图像上。 然后我们使用 Seurat 标签转移 (SrtLT) 来预测每种细胞类型的空间分布作为我们的参考。 细胞制图结果与参考文献之间的 KL 散度表明 CellTrek 成功地恢复了空间细胞结构，并且在三种方法中具有最低的 KL 散度

接下来，验证 CellTrek 是否可以进一步揭示同一细胞类型内细胞状态的拓扑模式。 例如，L5 IT 细胞包含五种表达状态，并在 UMAP 上以 Hsd11b1-Endou、Whrn-Tox2、Batf3、Col6a1-Fezf2 和 Col27a1 的顺序显示出连续趋势。 L5 IT CellTrek map发现了一个精炼的子层架构，这与之前的研究一致。 为了总结细胞空间共定位，我们使用基于 KL 的 MST 共识图将 SColoc 应用于 CellTrek 结果。 谷氨酸能神经元细胞类型按层结构的顺序构建了图形的线性主干。 到 L2/3 IT 细胞的空间 K 距离在图表的相同顺序中显示出显著增加的趋势（Spearman's rho = 0.91，P 2.2e-16）

然后，使用 SCoexp 研究了基因如何在 L5 IT 细胞中空间共表达。 鉴定了两个共表达模块（K1、K2）并显示出不同的生物学功能富集。 K1 模块在细胞状态 Hsd11b1-Endou、Whrn-Tox2 中高度活跃并在空间上位于外层，而 K2 模块在 Col27a1、Col6a1-Fezf2 和 Batf3 中高度活跃，主要位于内层。 这些结果表明 SCoexp 能够识别相同细胞类型内的细微转录差异并推断它们的拓扑异质性。

还将 CellTrek 应用于来自小鼠海马体的 Slide-seq v230 和 scRNA-seq 数据 。 Slide-seq 数据的无监督聚类确定了 12 个具有高度组织空间结构的聚类 (G01-G12)。 CellTrek 将单个细胞映射到它们的空间位置，这与 Slide-seq 集群一致。 值得注意的是，G06 与 Cornu Ammonis (CA) 区域匹配，而 CellTrek 揭示了 CA1、CA2 和 CA3 主细胞的顺序映射，这些主细胞无法单独通过 Slide-seq 聚类解决。 这些结果表明 CellTrek 可以广泛应用于不同的空间基因组平台，以实现更精细的空间细胞分辨率。

将 CellTrek 应用于公共小鼠肾脏数据 32 并将其与 NVSP-CellTrek 和 SrtCT 进行比较。 CellTrek 使用位于不同组织学区域（例如，皮质、外髓质和内髓质）的不同细胞类型准确重建了细胞空间结构。与 CellTrek 相比，NVSP-CellTrek 显示出相似的空间模式，而 SrtCT 无法重建小鼠肾细胞的准确空间组织。使用 SrtLT 作为参考，CellTrek 和 NVSP-CellTrek 都实现了整体低 KL 散度，NVSP-CellTrek 显示出更高的 VSMC 和 RenaCorp 细胞的 KL 散度。 SrtCT 显示与参考分布的最高 KL 散度。为了进一步研究空间细胞表达动态，我们分别推断了 ProxTub 和 DistTub 细胞的轨迹，并基于 CellTrek 对它们的伪时间进行了空间映射。对于 ProxTub 细胞，我们观察到从皮层外部到内部的连续空间轨迹。 ProxTub 细胞的这种连续解剖变化与之前的研究一致。同样，DistTub 细胞也显示出具有清晰空间模式的连续轨迹。总的来说，这些结果表明 CellTrek 可以解决组织中单细胞连续表达程序的拓扑排列。

接下来使用 SColoc 总结了一个细胞空间图。 ProxTub 细胞被确定为枢纽并连接到 RenaCorp、DistTub 和其他细胞类型。共识热图和层次聚类显示出与图抽象相似的模式。由于 scRNA-seq 数据是从小鼠肾脏的不同区域显微解剖中收集的，我们询问 CellTrek 是否可以在没有先验知识的情况下重述实验区域信息。根据 CellTrek 结果，我们计算了 TLLH、DistTub 和 Prin 细胞到中心区域的一组细胞的 K 距离。观察到一致的趋势是 Kdistances 从皮质到外髓质，然后到内髓质，这表明 CellTrek 成功揭示了小鼠肾脏的带状结构。此外，在 DistTub 细胞中，我们使用 SCoexp 确定了两个不同的空间共表达模块（K1 和 K2）。 K1 模块富含代谢途径、肾系统发育，并与一些远曲小管 (DCT) 基因高度相关。相比之下，K2 富含细胞基质途径、嘌呤代谢途径，并与远端直管 (DST) 经典基因相关。这两个模块在 UMAP 和 CellTrek 地图上显示了不同的模式。 K1在皮质区高度活跃，而K2在髓质区活跃，这与DCT和DST的解剖定位一致

进一步query CellTrek 是否可以通过利用空间信息来提高我们对细胞间通讯的理解。 我们使用 CellChat 对 scRNA-seq 数据进行了细胞-细胞相互作用分析，并使用 SColoc 图通过假设共定位的细胞将有更高的机会相互作用来过滤细胞-细胞对。 与原始 CellChat 结果相比，预测了所有细胞类型之间的许多非特异性相互作用，空间过滤提供了一组更简洁、更具体的减少的相互作用。 重要的是，分析确定了之前报道过的几种相互作用，包括 ProxTub 表达的 Vegfa 与其受体 Flt1 和 Kdr 相互作用，后者由 Vasc 表达

将 3' scRNA-seq（10X 基因组学）和 ST（Visium，10X 基因组学）应用于 DCIS 样本 (DCIS1)，以分析 6,828 个单细胞和 1,567 个 ST spot。 对于 scRNA-seq 数据，聚类和差异表达 (DE) 分析确定了 5 种主要细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、髓细胞和自然杀伤 (NK)/T 细胞

应用 CopyKAT 从 scRNA-seq 数据推断拷贝数分布。在所有肿瘤细胞中观察到一些克隆拷贝数改变 (CNA)，包括染色体 3q (PIK3CA)、8q (MYC) 和 19p (STK11) 的增加以及染色体 8p (PPP2R2A)、10q (PTEN) 和 14q 的丢失。 AKT1)。 CNA 谱的 UMAP 和 dbscan 聚类确定了三个主要肿瘤亚克隆 (clone1-3) 具有一些不同的改变，包括克隆 2 和克隆 3 中的 17q (ERBB2) 增益和 11q (ATM) 丢失，克隆 2 中的 1q（MDM4 和 EPHX1）增益和克隆 3 中的 6q (FOXO3) 丢失。基于共有的 CNA 谱，我们构建了一个系统发育树，显示克隆 1 是较早的亚克隆，与主要谱系不同，其次是克隆 2 和克隆 3。值得注意的是，这三个亚克隆表现出转录异质性。 Hallmark 基因集富集分析确定了所有三个亚克隆的几种常见途径，包括 MYC 靶标、氧化磷酸化和 DNA 修复。我们还确定了亚克隆特异性特征，包括富含克隆 2 和克隆 3 的雌激素反应途径，以及富含克隆 2 的干扰素 α/γ 反应、凝血和补体途径。

为了了解三个肿瘤亚克隆的空间分布，我们将 CellTrek 应用于 scRNA-seq 和 ST 数据。大多数肿瘤细胞映射到 HE 载玻片上的 DCIS 区域。此外，不同的肿瘤亚克隆映射到不同的导管区域，反映了广泛的肿瘤内空间异质性。具体而言，clone2 主要位于中间 (M) 导管，而 clone3 主要位于右侧 (R) 导管，而 clone1 分布在许多导管区域。 ST 肿瘤spot的无监督聚类确定了五个 ST cluster，它们显示空间和基因表达与肿瘤 CellTrek 图一致。基于每个导管的亚克隆组成，我们进行了聚类分析并计算了香农指数，产生了四个具有不同亚克隆组成和空间模式的主要导管簇。总体而言，来自组织右侧部分的导管显示出较低的克隆多样性，而来自中间和左侧区域的一些导管显示出较高的克隆多样性

使用 SCoexp 进一步研究了肿瘤细胞的空间共表达模式，并确定了三个基因模块（K1、K2 和 K3）。 K1 模块在 Clone1 中含量较高，并富含肌动蛋白相关通路。 CellTrek 显示具有高 K1 分数的细胞在空间上对应于肿瘤克隆 1。 相比之下，K2 在 Clone2 和 Clone3 中含量较高，并且富含对雌二醇、乳腺导管形态发生和一些分解代谢过程的反应。 有趣的是，K3 模块在增殖肿瘤细胞方面非常活跃，并且与细胞周期相关过程有关。 K3 评分的空间映射显示增殖的肿瘤细胞主要位于几个导管的外围区域附近。 总之，这些数据表明 CellTrek 工具包可以描绘不同肿瘤亚克隆的拓扑图及其在 DCIS 组织中的表达程序。

在另一个具有同步侵入性成分 (DCIS2) 的 DCIS 样本中，我们分析了 3,748 个单细胞（10X Genomics）和 2,063 个 ST spot（Visium，10X Genomics）。 无监督聚类和 DE 分析确定了 10 个簇，包括三个上皮簇、内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、髓细胞、NK/T、B 和浆细胞样树突细胞 (pDC)。 CopyKAT 揭示了一个带有 CNA 的非整倍体上皮Cluster（上皮 3）

HE 图像的组织病理学分析确定了 11 个带有肿瘤细胞的导管区域 (T1-T11) 和包含基质和免疫细胞的中间区域。为了研究肿瘤免疫微环境，我们专注于来自 scRNA-seq 数据的非整倍体细胞和免疫细胞。使用 CellTrek，我们将大部分非整倍体细胞映射到组织学定义的 DCIS 区域，将免疫细胞映射到导管和基质区域周围的区域。有趣的是，我们发现一些免疫细胞，包括 T、B、骨髓细胞和 pDC，聚集在导管外的区域，尤其是 T1、T2、T6 和 T7。将 CellTrek 结果与 HE 图像相结合，我们假设这些区域中存在三级淋巴结构 (TLS)。为了进一步研究这个问题，我们计算了 ST spot水平的 TLS 分数，发现具有高 TLS 分数的spot通常对应于我们 CellTrek 图中的混合免疫细胞聚集体。此外，我们发现 ST 级 TLS 分数与绘制的免疫细胞计数呈正相关（Pearson's R = 0.36，P = 1.2e-10）。总之，这些结果表明 CellTrek 能够基于 scRNA-seq 和 ST 数据重建空间肿瘤免疫微环境。

接下来，发现一些 T 细胞靠近肿瘤区域，一些位于肿瘤区域的远端。我们进一步分析了 T 细胞并将它们重新聚集成六种细胞状态，包括幼稚 T (NaiveT)、CD4+ T (CD4T)、CD8+ T (CD8T)、调节性 T 细胞 (Treg)、耗竭 CD4+ T (CD4Te) 和耗尽的 CD8+ T (CD8Te) 。研究了这些 T 细胞状态在 CellTrek 图中的分布。值得注意的是，Tregs、CD4Te 和 CD8Te 细胞大多靠近肿瘤细胞。进一步构建了 T 细胞内的空间图，发现来自相同谱系的细胞倾向于在空间上共定位。计算了 T 耗竭分数，发现耗竭分数高的 T 细胞倾向于定位在肿瘤区域附近。 T 细胞与其最近的 15 个肿瘤细胞的 K 距离显示出与 UMAP 上的 T 耗竭评分相反的趋势。正如预期的那样，与非抑制性 T 细胞相比，免疫抑制性 T 细胞（Treg、CD4Te 和 CD8Te）具有更高的耗竭评分。根据 K 距离将 T 细胞二值化为肿瘤远端 (TD) 和肿瘤近端 (TP) 组，发现 TP 组显示出明显高于 TD 组的耗竭评分（P = 1.1e-4），表明存在DCIS 导管区域附近的免疫抑制微环境。还发现了类似的趋势，其中 TP 与 TD 相比，CD4T 和 Treg 细胞的耗竭分数更高，而 NaiveT 细胞的趋势相反。重要的是，TD 组只包含很少的免疫抑制性 T 细胞，这与发现一致，即耗尽的 T 细胞倾向于共定位在 DCIS 区域附近。

髓细胞的重新聚类确定了四种细胞状态，包括常规树突状细胞 (cDC)、单核细胞和两种巨噬细胞亚群（Macro1 和 Macro2）。CellTrek 将大部分 cDC 投影到肿瘤近端区域。空间图显示 Macro2 细胞与Macro1和cDC共定位。然后我们计算了骨髓细胞到肿瘤细胞的K-距离，发现cDCs总体上显示出最低的K-距离，而Macro1细胞具有更高的K-距离。K-距离密度 图显示了类似的趋势。我们进一步检查了 Macro1 细胞的空间共表达，并使用 SCoexp 确定了两个主要基因模块（K1、K2）和一个次要模块。K1 模块在来自肿瘤远端区域的巨噬细胞中更活跃，并且相关 具有多个 C1Q 基因、HAVCR2、CD74、HLA-DRA 等。相反，K2 模块显示出相反的空间模式并与 CHIT1、CSTB、APOC1、MARCO 等相关

为了正交验证 CellTrek 推断的肿瘤和免疫细胞的空间分布，我们对来自 DCIS2 和另一个 DCIS 样本 (DCIS3) 的组织切片的靶向探针进行了免疫荧光 (RNAscope) 实验。该数据表明，DCIS 肿瘤细胞区域具有 ERBB2 的高表达，而 TAGLN 标记了导管的基底上皮层。此外，免疫抑制性 T 细胞标志物，包括 CTLA4 和 FOXP3，在 DCIS2 的 DCIS 区域附近具有高表达，这与 CellTrek 结果一致。同样，在 DCIS3 中，我们在导管附近发现了具有 CTLA4 和 FOXP3 的免疫抑制性 T 细胞。此外，该数据显示 B 细胞 (MS4A1)、单核细胞/巨噬细胞 (CD68) 和树突状细胞 (CD1C) 也在 DCIS 导管区域附近，表明存在 TLS，并且与 DCIS2 的 CellTrek 结果一致。相比之下，在同一组织切片的正常小叶上皮区域中观察到的免疫细胞较少，尤其是免疫抑制性 T 细胞标志物。这些数据证实了我们对使用 CellTrek 推断的 DCIS 肿瘤免疫微环境的发现。

在这里，作者开发了一种新的计算工具 CellTrek，用于基于 scRNA-seq 和 ST 数据重建空间细胞图。与传统的去卷积方法相比，CellTrek 提供了一种新范式，可以将单个细胞直接投影到组织切片中的空间坐标，从而充分利用 scRNA-seq 数据。我们还开发了两个下游计算模块（SColoc 和 SCoexp）来进一步分析 CellTrek 结果。通过重建蜂窝空间图，CellTrek 提供了几个优势。首先，它提供了一种灵活的方法来以空间方式研究单个细胞的任何特征（例如，细胞类型/状态、伪时间），而大多数 ST 解卷积方法只能将SPOT分解为细胞类型，无法实现单细胞级特征映射.其次，CellTrek 非常灵活，可以将任何细胞位置概率/相似性矩阵作为输入来重建细胞图，从而实现进一步的下游分析。第三，通过利用度量学习方法和非线性插值，CellTrek 允许以更高的空间分辨率进行更准确的细胞绘图。最后，随着更高空间分辨率测序技术的发展，CellTrek 完全能够将单个细胞绘制到其他空间测序数据，以提供更高的空间粒度。

首先使用模拟和原位数据集对 CellTrek 性能进行基准测试，然后评估不同数据条件下的准确性和稳健性。 通过将 CellTrek 工具包应用于来自小鼠大脑和肾脏的两个“完善”的数据集，我们展示了其恢复不同细胞类型拓扑结构的能力。 进一步表明，CellTrek 可以通过将分类（即细胞状态）和连续特征（即伪时间）映射到组织切片来识别高分辨率子结构。 SColoc 还可以将不同细胞类型的空间关系重建为图形，可进一步用于细胞间通讯分析。 此外，SCoexp 可以检测多种细胞类型内的空间共表达模块，显示组织切片中的拓扑模式。

在研究中，我们对两个 DCIS 样本进行了匹配的 scRNA-seq 和 ST 实验，并应用 CellTrek 工具包来描绘不同导管区域中肿瘤亚克隆的空间分布和肿瘤免疫微环境的拓扑组织。 在 DCIS1 中，我们发现三个肿瘤亚克隆定位于具有不同克隆多样性水平的不同导管。 尽管先前已经观察到形态学和基因组肿瘤内异质性，但在这里我们报告了 DCIS 组织中导管网络内的空间异质性。 在 DCIS2 中，CellTrek 准确映射了肿瘤

国卫院首度发现：琥珀酸在肿瘤微环境扮演关键角色

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癌症治疗最大的问题，在于癌细胞有破坏周围组织与改变癌细胞生长环境的能力，因此能够转移，例如原本能够对抗癌细胞的免疫巨噬细胞，会因为致癌因子，转变为有助肿瘤生长的肿瘤相关巨噬细胞。

国家卫生研究院细胞及系统医学研究所郭呈钦副研究员带领研究团队吴京颖博士后研究员等人，利用人类癌细胞株及肿瘤小鼠模型进行研究，发现癌细胞会释放琥珀酸(succinate)到肿瘤微环境当中，并透过活化癌细胞膜上的琥珀酸受体(SUCNR1)，将免疫巨噬细胞极化(polarization)成肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，进而助长肿瘤生长与转移。研究团队进一步与三军总医院黄才旺医师及许育瑞医师团队共同合作，针对非小细胞肺癌(NSCLC)患者检体进行检测，发现患者血液中琥珀酸浓度比起正常人高出1.8倍，表示琥珀酸浓度与非小细胞肺癌的肿瘤发展具高度正相关。此项研究成果为全球首度发现血中琥珀酸可作为非小细胞肺癌疾病预防与临床诊断的生物标记(biomarker)，可望提供癌症治疗在临床策略与新药研发带来新方向。研究成果于今(109)年1月刊登于国际权威期刊《Molecular Cell》。

肿瘤微环境，指的是肿瘤细胞存在的周围环境，包含周围的血管、免疫细胞等等。一般而言，癌细胞会在肿瘤微环境中释放可溶性分子，同时也会透过影响周围的免疫细胞来试图打造适合癌细胞生长的环境。在肿瘤微环境里面，免疫巨噬细胞是主要的细胞群，也是常被癌细胞锁定的对象。

研究团队以比较代谢体学(Comparative metabolomics)分析不同癌细胞株的培养液，发现癌细胞（包括肺癌、乳癌、前列腺癌与大肠癌）会释放琥珀酸(succinate)到肿瘤微环境，透过活化琥珀酸受体(SUCNR1)及下游PI3K/HIF-1途径传递信号，将免疫巨噬细胞极化为肿瘤相关巨噬细胞，来助长癌细胞的生长与转移。郭博士表示，透过琥珀酸受体剔除细胞株与动物实验当中，证实背后的作用机制即是琥珀酸借由活化琥珀酸受体来促进免疫巨噬细胞极化成肿瘤相关巨噬细胞。研究进一步分析，将癌细胞与巨噬细胞共同培养之后发现，受琥珀酸诱导极化的巨噬细胞具有助长癌细胞迁移的能力；同时在注射琥珀酸的肿瘤老鼠模型中，亦发现琥珀酸会增加肿瘤围环境的肿瘤相关巨噬细胞，而且癌细胞转移的现象也更为明显。上述分析结果皆显示，琥珀酸在癌细胞生长与转移的肿瘤微环境中扮演重要角色。

同时，研究团队进行临床数据分析，针对非小细胞肺癌临床检体，比较肺癌患者与健康民众的血中琥珀酸浓度，发现肺癌病人具有较高的血中琥珀酸浓度，而透过AUROC统计分析方法，亦显示血中琥珀酸与肺癌生长发展具有高度鉴别度，代表血中琥珀酸浓度将可作为诊断肺癌发展进程的生物分子标记。

郭博士表示，透过解开琥珀酸在肿瘤微环境的关键机制，有助于未来开发癌症医疗的生物标记检测套组以及抗癌单株抗体的标靶药物。目前研究团队已发展出抗琥珀酸单株抗体，并在肿瘤老鼠实验中证实，抗琥珀酸单株抗体能够有效抑制肿瘤相关巨噬细胞的生成及癌细胞的转移，进而提高肿瘤老鼠的存活率。目前「血清琥珀酸作为癌症诊断生物标志物和抗琥珀酸单株抗体用于癌症治疗」这项研究成果正在申请美国临时专利，相信未来将能为国内开发癌症药物与医疗策略带来新方向。

话题： 国家卫生研究院, 琥珀酸, 癌症