外泌体中的mirna如何检测（如何检测外泌体中的miRNA）

本文目录一览：

• 1、如何筛选目的基因的miRNA
• 2、如何预测和鉴定miRNA的靶基因
• 3、检测mirna与dna序列直接作用用什么方法
• 4、如何用qrt-pcr检测mirna的表达水平
• 5、一般的RNA-seq能不能检测到miRNA了
• 6、如何验证长链非编码rna与mirna

如何筛选目的基因的miRNA

你指的是寻找miRNA的靶基因位点吗？

一般都是利用生物信息学软件进行预测，但这种预测都是有局限性的，比如miRNA可能会与靶基因之间产生错配，这样会丢失一些靶基因，另外预测的都未经过实验的验证，还需要进行实验的验证来去伪存真。

当然植物可以使用降解组测序的方法来进行靶基因预测，原理就是植物中miRNA与mRNA往往是碱基近乎完全匹配来结合后将mRNA降解，剪切位点通常位于miRNA的第十位或第十一位碱基，被剪切后的片段可以通过建库后进行测序，可以真实的得到miRNA在mRNA上的作用位点的序列。

动物的就不行了，动物中一般是miRNA结合在mRNA上对mRNA翻译进行抑制，无法像植物那样得到其降解后的小片段进行测序验证

如何预测和鉴定miRNA的靶基因

利用各种生物信息学方法和实验方法来寻找miRNA的靶基因。，鉴定miRNA靶基因的最常用方法是依赖计算机算法，如TargetScan、MiRanda和PicTar。它们预测miRNA种子区的结合。种子区（seed region）指的是miRNA上进化最为保守的片段，从第2个到第8个核苷酸，通常与mRNA 3’-UTR上的靶位点完全互补。

检测mirna与dna序列直接作用用什么方法

microRNAs（miRNA）是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链），但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNA）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA接到的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中发现的lin－4和let－7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA。

miRNA有高等生物基因组编码,通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。其在物种进化总相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中其多种作用。

microRNAs的作用机制

miRNA是一类多细胞动物或植物基因组的前体mRNA内含子，miRNA独立转录单位或miRNA基因簇编码的19-25个核苷酸大小的内源性单链RNA，他们在转录后水平沉默特定基因从而对生物体基因表达起到精细调节的作用[1]。绝大多数miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成较长的茎环结构，称为初级miRNA（primary miRNA ,pri- miRNA）。pri- miRNA在Drosha-DGCR8复合体的作用下形成长度约60-70个核苷酸的发夹状RNA，成为前体miRNA（precursor miRNA,pre-miRNA)。随后，pre- miRNA在Exprotin－5复合物[2]的作用下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为miRNA复合体， miRNA复合物（RNA－induced silencing comlex，RISC）[1]与该miRNA的3’翻译区（3’UTR）结合到位于胞浆的P－body（processing bady）中[3]：如果miRNA与靶mRNA匹配完全，则该复合体降解mRNA；若两者序列部分匹配，尤其是miRNA的5’端2-8个被称为种子序列（seed sequence）的核苷酸与靶mRNA匹配完好，则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因。此外，某些miRNA，如miRNA－16能够特异结合于某些基因3’UTA的富含AU元件（AU rich element,ARE）,指导Ago等组成RISC区的蛋白与TTP结合，从而改变相应mRNA的半衰期，加速靶mRNA的降解。

此外，miRNA也可能抑制5’UTR含有内部核糖体进入位点（intrnal ribosome entry sites,IRESs）的靶标分子[4]。

miRNA的表达调控机制

①顺时调控元件 大多数miRNA基因的核心启动子区域含有TA盒，并且含有影响miRNA表达的细胞特异转录调节元件。miRNAs作为转录因子重要的靶分子在细胞功能调控中发挥核心作用。

②表观遗传学 最近一些研究提示，表观遗传学变化会影响miRNA 基因，从而调节miRNA表达。分析基于miRNAse（release 8.0）数据库的332个人miRNA基因序列时，发现其中155个miRNA的基因序列上游或下游2000bp处含有CG岛在miR-127[6],miR-24a[6],let-7a-3[7]和miR－370[8]基因中，均含有CpG岛，并且在相应地肿瘤组织中呈现高度甲基化，这些miRNA在肿瘤中的甲基化沉默将导致他们的靶基因－原癌基因（BCL6，CDK6和MAP3K8等）的表达，从而促进肿瘤发育。转录因子PRDM5可能参与了调解miRNAs基因的表观遗传学变化。在HEK293细胞中，PRDM5可以募集蛋白甲基化转移酶G9a和一类组蛋白去乙酰基酶等组蛋白修饰到has－mir－135b基因的启动子区域，行使抑制功能[9],miRNA在癌症细胞中的表达一般低于正常组织细胞，这表明多数miRNAs可能作为肿瘤抑制因子而发挥作用。原癌基因的低度甲基化和肿瘤抑制基因的高度甲基化被认为是癌症表观遗传学的主要决定因素。miRNAs基因在肿瘤中的异常甲基化使表观遗传学调控癌症机理更加复杂。

③单核苷酸多态性 存在于pri－mRNAs，pri－mRNA或成熟miRNAs基因序列中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）能够潜在地影响miRNA调节的细胞功能网络。miRNA基因或靶结合位点及其临近靶位点区域的多态变化时，于miRNA的生物合成及靶位点选择和抑制效应据重要的意义。

④RNA编辑 （RNA editing）是基因在初级转录物上增删或取代某些核苷酸而改变遗传信息的过程，从而可调节基因的表达。RNA编辑在miRNA调控基因默过程中其重要作用，不仅影响miRNA表达，而且影响特异miRNA的靶向分子的调控。此外，At编辑也有可能存在于靶分子的种子互补区域。

如何用qrt-pcr检测mirna的表达水平

miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。

最近的研究表明它们影响了约三成的基因。

miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。

同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。

一般的RNA-seq能不能检测到miRNA了

不能,miRNA成熟体太短了,在20~24nt左右波动,首先建库前可能就没有将Total RNA中的miRNA保留下来,更不可能去测了,所以通常所说的RNA-Seq就是测一下mRNA而已.

要检测出miRNA,在前期样品提取、样品建库过程上有所改变.

如何验证长链非编码rna与mirna

长链非编码RNA长度大于200nt，MicroRNA（miRNA）长度约19-24nt，可以通过电泳检测，也可以通过PCR检测 。